优化肾脏体外培养条件
支持肾脏发育超越E15.5阶段，实现体外成熟
系统优化小鼠肾脏外植体培养，鉴定出v2培养基，支持肾单位、集合管、基质和输尿管的体外成熟，并进一步修改为v3培养基用于人类KPA培养。
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空间图案化肾脏组装体重现祖细胞自组装并实现高保真体内疾病建模
Spatially patterned kidney assembloids recapitulate progenitor self-assembly and enable high-fidelity in vivo disease modeling.
实验完整度
高包含体外类器官、体内移植、单细胞多组学、功能检测及疾病模型验证等多层级证据
主要模型
小鼠肾脏祖细胞组装体（mKPA） 人类肾脏祖细胞组装体（hKPA） NSG小鼠移植模型
重点核对
mKPA由Six2-GFP+ NPCs和Hoxb7-Venus+ UPCs在v2培养基中组装，培养3周形成约150个肾单位 hKPA由iNPCs和iUPCs在v3培养基中组装，TTNPB为极化肾泡形成所必需 mKPA移植到NSG小鼠肠系膜，14-27天后检测囊肿液尿素和肌酐 hKPA移植到NSG小鼠肾包膜下，14-70天后评估血管化和功能 PKD2-/- hKPA移植后2个月形成囊肿，重现ADPKD特征
摘要
当前的肾脏类器官不能重现肾脏复杂的空间图案和功能，限制了其应用。人类肾脏包含一百万个肾单位，来源于肾单位祖细胞，连接到由分支的输尿管祖细胞衍生的集合系统。在这里，我们开发了空间组织的小鼠和人类肾脏祖细胞组装体（KPA）模型，其中肾单位经历广泛发育并融合到位于中央的集合系统，重现了体内观察到的肾脏祖细胞自组装过程。KPAs显示出显著改善的细胞复杂性、成熟度，并在体外和体内表现出主要肾脏功能的几个方面。用基因组编辑的、体内生长的人类KPAs模拟人类常染色体显性多囊肾病（ADPKD），重现了囊性表型以及该疾病的分子和细胞标志，并突出了囊肿上皮、基质和巨噬细胞之间的相互作用。KPA平台为高保真疾病建模开辟了新途径，并为肾脏再生医学奠定了坚实基础。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否构建空间图案化的肾脏组装体，以重现肾脏祖细胞自组装并实现高保真疾病建模？
- 核心机制
- NPCs和UPCs的相互作用诱导极化肾泡形成，肾单位与中央集合系统连接；RA信号通过WNT4诱导NPC向极化肾泡分化。
- 主要证据
- 小鼠和人类KPAs在体外和体内展示出空间组织的肾单位、集合管、基质和血管化，并表现出肾小球滤过、肾小管重吸收和分泌及内分泌功能；PKD2-/- hKPA移植模型重现ADPKD的囊肿、纤维化和巨噬细胞浸润。
- 研究意义
- KPA平台为高保真疾病建模和肾脏再生医学奠定了基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
从小鼠NPCs和UPCs组装mKPA
构建空间组织的小鼠肾脏祖细胞组装体
将体外扩增的Six2-GFP+小鼠NPCs和Hoxb7-Venus+小鼠UPCs在v2培养基中共同培养，形成mKPA，肾单位发育并与中央集合管连接。
mKPA的体外功能验证
验证mKPA的肾小管转运和内分泌功能
进行右旋糖酐和白蛋白摄取实验、DAPI和6-CF转运实验、肾素分泌实验、EPO分泌实验以及维生素D3代谢实验。
mKPA体内移植与功能分析
促进mKPA血管化并连接循环，进一步分析功能
将D3 mKPA移植到NSG小鼠肠系膜，14-27天后分析囊肿液、血管化和肾功能。
从iNPCs和iUPCs组装hKPA
构建空间图案化的人类肾脏祖细胞组装体
将iNPCs和iUPCs在v3培养基中组装，形成hKPA，肾单位发育并与中央集合管连接；TTNPB对于极化肾泡形成至关重要。
hKPA的体外功能验证
验证hKPA的肾小管转运功能
进行TRITC-白蛋白和BOCILLIN FL青霉素摄取实验。
hKPA体内移植与功能分析
实现hKPA血管化并分析体内功能
将RV阶段hKPA移植到NSG小鼠肾包膜下，1个月后分析血管化、肾小球滤过和肾小管重吸收。
ADPKD疾病建模
利用PKD2-/- hKPA在体内模拟ADPKD
将PKD2-/- hKPA移植到NSG小鼠，2个月后分析囊肿形成、纤维化和巨噬细胞浸润。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | mTeSR1 Plus培养基 | STEMCELL Technologies | 100-0276 |
| 基质胶 | R&D Systems | 3433-010-01 | |
| Versene溶液 | Thermo Fisher | 15040066 | |
| 组织解离 | Accumax细胞解离液 | Innovative Cell Technologies | AM105 |
| 细胞计数 | TC20自动细胞计数仪 | Bio-Rad | 1450102 |
| Matrigel溶解 | 细胞回收溶液 | Corning | 47743-696 |
| 细胞聚集 | U型底96孔板 | Thermo Fisher Scientific | 174929 |
| 器官培养 | Transwell小室 | Corning | 3450 |
| qPCR | iScript逆转录预混液 | Bio-Rad | 1708841 |
| Ssoadvanced通用SYBR | Bio-Rad | 1725274 | |
| AzuraView GreenFast qPCR Blue Mix LR | Azura Genomics | AZ-2320 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | 15596026 |
| Direct-zol RNA微量制备试剂盒 | Zymo Research | R2062 | |
| Quick-RNA微量制备试剂盒 | Zymo Research | R1051 | |
| RNA保存 | DNA/RNA保护剂 | Zymo Research | R1100-50 |
| 尿素定量 | QuantiChrom尿素检测试剂盒 | BioAssay Systems | DIUR-100 |
| 肌酐定量 | QuantiChrom肌酐检测试剂盒 | BioAssay Systems | DICT-500 |
| 原位杂交 | RNAscope多重荧光试剂盒v2 | Advanced Cell Diagnostics, Inc. | 323100 |
| 单细胞多组学 | 10X Chromium Next GEM单细胞多组学ATAC+基因表达试剂盒 | 10X Genomics | PN-2000264 |
| 细胞凋亡检测 | Click-iT Plus TUNEL原位凋亡检测试剂盒，Alexa Fluor 488染料 | Thermo Fisher Scientific | C10617 |
| 免疫荧光 | Fluoromount-G封片剂 | SouthernBiotech | 0100-01 |
| OCT包埋剂 | Scigen | 4586K1 | |
| ImmEdge疏水屏障笔 | -- | -- | |
| 多光子显微镜 | Alexa Fluor 680标记的白蛋白 | ThermoFisher | A34787 |
| 荧光黄标记的右旋糖酐（10,000 MW） | Thermo Fisher Scientific | D-1825 | |
| 细胞培养 | TTNPB | Cayman Chemical | 16144 |
| FGF9 | R&D Systems | 273-F9-025 | |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | |
| 佛司可林 | Sigma-Aldrich | F3917-10MG | |
| 醛固酮 | Sigma-Aldrich | A9477 | |
| 加压素 | Sigma-Aldrich | V0377-100IU | |
| dDAVP | Sigma-Aldrich | V1005-.1MG | |
| 氢化可的松21-半琥珀酸酯（钠盐） | Cayman Chemical | 18226 | |
| A83-01 | Cayman Chemical | 9001799 | |
| 功能实验 | TRITC标记的白蛋白 | Sigma-Aldrich | A2289-10MG |
| 丙磺舒 | Cayman Chemical | 1498-5MG | |
| 西咪替丁 | Cayman Chemical | 18743 | |
| 6-羧基荧光素 | Thermo Fisher Scientific | C1360 | |
| BOCILLIN FL青霉素 | Thermo Fisher Scientific | B13233 | |
| 荧光素甲氨蝶呤 | Thermo Fisher Scientific | M1198MP | |
| 内分泌实验 | 25-羟基维生素D3 | Cayman Chemical | 9000683-1MG |
| 甲状旁腺激素(1-34) | ApexBio | A1129-5MG |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| mKPA组装 | NPC和UPC细胞数量及比例；聚集和培养条件 阅读提示：Methods: Generation of mKPA from expandable mouse NPCs and UPCs |
| hKPA组装 | iNPC和iUPC细胞数量；TTNPB浓度；培养基阶段转换时间 阅读提示：Methods: Generation of human kidney progenitor assembloids from expandable iNPCs and iUPCs |
| mKPA移植 | 移植部位（肠系膜）；移植时间（D3）；移植数量（4-5个）；分析时间点（14-27天） 阅读提示：Methods: Mouse Kidney Progenitor Assembloid transplantation into immunodeficient NSG mice |
| hKPA移植 | 移植部位（肾包膜下）；移植时间（D5-D7）；移植数量（5-10个）；分析时间点（14-70天） 阅读提示：Methods: Human kidney progenitor assembloids transplantation into immunodeficient NSG mice |
| ADPKD建模 | PKD2-/- iNPCs和iUPCs来源；移植后分析时间（2个月） 阅读提示：Results: High-fidelity in vivo modeling of human autosomal dominant polycystic kidney disease; Methods: hKPA transplantation |