建立PAX7::GFP hESC报告系并体外分化获得MPC
获得可用于追踪和分选的肌源性祖细胞。
通过CRISPR-Cas9在PAX7基因3' UTR前敲入GFP，生成PAX7::GFP hESC系，经无血清分步肌源性诱导方案分化，第18天检测到PAX7表达，第18至30天细胞数逐渐增加至7.56±3.33%，FACS富集PAX7::GFP+ MPC并在FGF2存在下体外扩增。
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人多能干细胞来源的肌源性祖细胞在移植后成熟为静息卫星细胞
Human pluripotent stem cell-derived myogenic progenitors undergo maturation to quiescent satellite cells upon engraftment.
实验完整度
高包含体外分化、单细胞RNA测序、系列移植、再损伤及NSG-mdx小鼠功能验证等多层级证据。
主要模型
PAX7::GFP hESC来源的肌源性祖细胞（MPC） NSG免疫缺陷小鼠（TA肌内移植） NSG-mdx4Cv小鼠（DMD模型）
重点核对
移植细胞数：1×10^6 PAX7::GFP MPCs/肌肉，二次移植为FACS分选的PAX7::GFP+细胞（数量为几百个，文中未明确具体数目） 宿主预处理：NSG小鼠TA照射（18 Gy）后72小时注射50 μl 1.2% BaCl2损伤 移植后检测时间点：4周；再损伤在首次移植后4周进行；二次移植在首次移植后4周分选细胞后进行 NSG-mdx4Cv移植：TA、腓肠肌、股四头肌各注射1×10^6细胞，不经照射或损伤 跑步机力竭测试：5 m/min热身5 min，随后每分钟增加1 m/min至10 m/min；静止于电击垫超过10秒（第三次）判定力竭
摘要
人多能干细胞（hPSC）来源的肌源性祖细胞（MPC）移植是治疗多种退行性肌肉疾病的一种有前景的方法。本文中，我们利用MPC特异性荧光报告系统（PAX7::GFP）证明，hPSC来源的MPC在局部损伤后以及抗肌萎缩蛋白缺陷（mdx）小鼠中能够参与肌纤维的再生。我们还证明，一部分PAX7::GFP MPC定植于再生肌纤维的基底膜内，进入静息状态，并在再次损伤后以及mdx小鼠模型中参与再生。这部分PAX7::GFP MPC经历成熟过程，并在体内移植后重塑其分子特征，使其类似于晚期胎儿MPC/成年卫星细胞。这些体内成熟的PAX7::GFP MPC保留了细胞自主的再生能力，并可在二次受体小鼠的生态位中重新定植，为未来基于hPSC的肌肉疾病细胞治疗提供了概念验证。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- hPSC来源的MPC能否在移植后成为静息卫星细胞、占据卫星细胞生态位并提供长期再生能力？
- 核心机制
- 移植后的PAX7::GFP MPC在体内微环境作用下下调细胞周期和分化相关基因、上调静息及生态位归巢相关基因，进入G0期并获得静息卫星细胞样分子特征，从而具备再次损伤后再生和系列移植重建能力。
- 主要证据
- 利用PAX7::GFP报告系统在NSG小鼠TA移植模型中追踪供体细胞，结合单细胞RNA测序、单细胞QPCR、Pyronin Y/Hoechst细胞周期分析、再损伤实验、二次移植实验以及NSG-mdx4Cv小鼠的肌纤维形成和跑步机功能测试。
- 研究意义
- 为未来基于hPSC的肌肉疾病细胞治疗提供了概念验证，并提示移植的MPC可在体内成熟为具有长期再生能力的静息卫星细胞。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
比较未分选肌源性细胞与FACS分选扩增的PAX7::GFP MPC的移植效果
确定富集PAX7::GFP MPC是否增强移植后肌纤维形成。
将未分选hESC来源肌源性细胞与FACS分选并传代两次的PAX7::GFP MPC分别移植到经照射和BaCl2损伤的NSG小鼠TA，4周后通过huDystrophin和huLaminA/C免疫染色评估供体来源肌纤维。
检测移植后PAX7::GFP+细胞在卫星细胞生态位的定位
验证移植的MPC能否定植于肌纤维基底膜内。
移植4周后，对TA切片进行PAX7和huLaminA/C双标，观察供体来源细胞是否位于基底膜内；同时通过FACS从移植后肌肉中分离GFP+细胞并进行单细胞QPCR检测PAX7、GFP、CALCR和PMP22表达。
单细胞RNA测序分析移植后PAX7::GFP+细胞的转录组变化
明确移植后细胞是否获得静息卫星细胞分子特征及发育阶段。
对移植后4周分离的176个PAX7::GFP+细胞进行scRNA-seq，并与体外PAX7::GFP+细胞（117个）、体外培养1个月的PAX7::GFP+细胞（83个）和未分化hESC（76个）比较；加入ERCC spike-in进行RNA含量归一化，使用SingleCellNet分类静息/激活特征及发育阶段。
验证移植后PAX7::GFP+细胞的静息状态和细胞周期
确认移植后细胞退出细胞周期进入静息状态。
对体内PAX7::GFP+细胞和体外PAX7::GFP+细胞进行Pyronin Y和Hoechst染色流式细胞周期分析，检测G0期比例。
再损伤实验验证移植后细胞的再生能力
检验定植的PAX7::GFP+细胞能否在再次损伤后参与肌纤维再生。
首次移植4周后，用50 μl 1.2% BaCl2再次损伤同一TA，再损伤4周后通过huDystrophin和huLaminA/C免疫染色评估供体来源肌纤维。
二次移植实验验证体内PAX7::GFP+细胞的干细胞功能
检验体内成熟的PAX7::GFP+细胞能否在二次受体中重新定植并形成肌纤维。
从首次移植后4周的小鼠TA中FACS分离PAX7::GFP+细胞，移植到经照射和损伤的二次受体NSG小鼠TA，4周后评估huDystrophin+肌纤维、PAX7+细胞定植及移植效率；同时比较400个PAX7::GFP MPC直接移植的效果。
NSG-mdx4Cv小鼠移植及功能评估
验证PAX7::GFP MPC在DMD模型中的肌纤维形成和功能改善。
将PAX7::GFP MPC注射到NSG-mdx4Cv小鼠的TA、腓肠肌和股四头肌（每块肌肉1×10^6细胞），不进行照射或损伤；4周后检测huDystrophin+肌纤维，并进行跑步机力竭测试和TA抗疲劳生理测试。第二队列在移植前进行2周跑步机运动（10 m/min，10分钟，每周3次）诱导损伤。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Geltrex基质胶 | Gibco | -- |
| CHIR99021 | Cayman | 13122 | |
| DAPT | Cayman | 13197 | |
| 成纤维细胞生长因子2 | Pepro Tech | 100-18B | |
| Y-27632 | Tocris | 1524 | |
| 动物实验 | 氯化钡 | Sigma | 342920 |
| 流式分析 | Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 |
| 派洛宁Y | Thermo Scientific | J61068.09 | |
| 免疫染色 | PAX7抗体 | DSHB | RRID:AB_528428 |
| 抗人抗肌萎缩蛋白抗体 | Millipore | MABT827 | |
| Lamin A/C单克隆抗体 | Thermo Fisher | MA3-1000 | |
| 抗层粘连蛋白抗体 | Sigma | L9393 | |
| 抗人层粘连蛋白抗体 | DSHB | 2E8 | |
| GFP多克隆抗体 | Invitrogen | A10262 | |
| 单细胞QPCR | KAPA SYBR FAST qPCR预混液(2X)试剂盒 | Kapabiosystems | KR0389 |
| 基因组诊断PCR | Phire组织直接PCR预混液 | Thermo Scientific | F170S |
| RNA提取 | Quick-RNA微量制备试剂盒 | Zymo Research | R1050 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| MPC体外分化与分选 | 分化方案：CHIR99021 3 μM处理4天，DAPT 10 μM处理8天，N2培养基继续分化13天；FACS分选PAX7::GFP+细胞；分选后扩增7天时PAX7::GFP+比例为30±10.0% 阅读提示：STAR Methods中Myogenic cell derivation and cell culture小节及Figure S1 |
| NSG小鼠移植前预处理 | 8周龄NSG小鼠，TA照射18 Gy后72小时注射50 μl 1.2% BaCl2损伤；移植1×10^6 PAX7::GFP MPCs/50 μl含ROCK抑制剂Y-27632的培养基 阅读提示：STAR Methods中Animal and cell transplantation strategy小节 |
| 移植后检测时间点与分析方法 | 移植后4周取材；免疫染色检测huDystrophin、huLaminA/C、PAX7、human laminin；FACS分离GFP+细胞进行单细胞QPCR或scRNA-seq 阅读提示：Figure 1图注及STAR Methods中Isolation of mononuclear cells from TA for FACS和Immunocytochemistry小节 |
| 再损伤与系列移植实验 | 首次移植后4周用50 μl 1.2% BaCl2再损伤；系列移植在首次移植后4周FACS分选PAX7::GFP+细胞并移植到经照射和损伤的二次受体TA；二次移植细胞数量为几百个（文中未明确具体数目） 阅读提示：Figure 4图注及STAR Methods中Animal and cell transplantation strategy小节 |
| NSG-mdx4Cv小鼠移植与功能测试 | 8-12周龄NSG-mdx4Cv小鼠，TA、腓肠肌、股四头肌各注射1×10^6细胞/50 μl，不照射不损伤；跑步机力竭测试方案；第二队列运动预适应方案 阅读提示：Figure 4图注、STAR Methods中Animal and cell transplantation strategy和Treadmill exhaustion test小节 |