体内RNAi筛选鉴定协同基因
鉴定与Tet2缺失白血病前HSPC协同促进髓系恶性肿瘤的信号状态。
将靶向泛素化及蛋白酶体调节因子的shRNA文库转导Tet2−/− lineage−cKit+ HSPC，移植致死性照射受体小鼠，监测疾病并对脾脏白血病细胞shRNA深度测序。
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TRAF6通过直接靶向MYC致癌活性在髓系恶性肿瘤中发挥抑癌作用
TRAF6 functions as a tumor suppressor in myeloid malignancies by directly targeting MYC oncogenic activity.
实验完整度
高包含体内RNAi筛选、小鼠骨髓移植模型、患者样本及组学数据，并进行泛素化与乙酰化机制验证
主要模型
Tet2−/−小鼠造血干细胞/祖细胞（LSK） Traf6−/−;Tet2−/−小鼠骨髓移植模型 人类AML/MPN患者样本 MV4;11 AML细胞系
重点核对
体内RNAi筛选以Tet2−/− cKit+骨髓细胞转导shRNA文库后移植致死性照射小鼠，并以sh-p53和sh-Ncst为阳性对照 竞争性骨髓移植中供体来源PB嵌合率及HSPC比例，原代和二次移植追踪4个月 10058-F4以20 mg/kg腹腔注射，每周3次或隔日，持续3周，评估PB嵌合率 TRAF6泛素化MYC的K148位点，K148R突变体阻断泛素化，K63R泛素阻断K63连接链 MV4;11(K148R)与亲本MV4;11细胞尾静脉注射5×10^5细胞至亚致死照射NSGS/NSG小鼠，评估植入和生存
摘要
克隆性造血（CH）是一种与衰老相关的状态，其特征是获得特定突变的白血病前细胞发生克隆性扩增。尽管CH个体表现健康，但其发生髓系恶性肿瘤的风险增高，提示从白血病前阶段向显性白血病转变还需要额外改变。为鉴定与白血病前细胞协同的信号状态，我们采用体内RNAi筛选方法。筛选中最为显著的基因之一是泛素连接酶TRAF6。白血病前细胞中TRAF6缺失可导致显性髓系白血病，并与MYC依赖的干细胞特征相关。部分髓系恶性肿瘤患者中TRAF6受到抑制，提示TRAF6信号被颠覆可导致急性白血病。机制上，TRAF6对MYC进行泛素化，该事件不影响其蛋白稳定性，而是通过拮抗一种乙酰化修饰抑制其功能活性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在克隆性造血相关白血病前突变（如TET2缺失）背景下，哪些信号状态协同促进向显性髓系恶性肿瘤转化。
- 核心机制
- TRAF6作为E3泛素连接酶对MYC K148位点进行K63连接泛素化，拮抗同一残基的乙酰化，从而抑制MYC转录活性；TRAF6缺失导致MYCK148乙酰化增加、MYC活性增强，促进白血病转化。
- 主要证据
- 体内RNAi筛选发现Traf6；Traf6−/−;Tet2−/−小鼠发生完全外显、可移植的MPN/AML；RNA-seq显示MYC特征富集；10058-F4或shMYC抑制Traf6−/−;Tet2−/− HSPC集落再形成；质谱、免疫共沉淀和体外泛素化实验证实TRAF6泛素化MYC K148；K148Q编辑增强MYC特征并增加白血病负荷，K148R减弱。
- 研究意义
- 揭示TRAF6在髓系恶性肿瘤中具有情境依赖的抑癌样功能，提示TLR-TRAF6信号被颠覆参与白血病前HSPC向AML/MPN转化，并揭示MYC K148乙酰化对其致癌活性的调控。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Traf6与Tet2条件性敲除小鼠造血表型分析
确定Traf6缺失对白血病前HSPC集落形成、竞争性重建和髓系偏移的影响。
将Traf6f/f与Tet2f/f小鼠与VavCre或Mx1Cre交配，进行甲基纤维素集落再形成实验和竞争性骨髓移植，追踪供体PB嵌合率和HSPC比例。
Traf6/Tet2缺失诱导髓系白血病模型
评估Traf6与Tet2联合缺失是否导致显性、可移植的髓系恶性肿瘤。
将VavCre来源的WT、Traf6−/−、Tet2−/−和Traf6−/−;Tet2−/− BM细胞移植致死性照射WT小鼠，监测血液病，进行PB计数、组织病理和二次移植。
人类AML/MPN中TRAF6表达与遗传改变分析
确定人类髓系恶性肿瘤中TRAF6是否受遗传或表观机制抑制。
分析公共AML/MPN数据集中的TRAF6拷贝数、突变、mRNA表达、启动子甲基化及蛋白表达，并按FAB分型、原发与继发MDS后AML及生存分层。
MYC依赖性功能验证
验证TRAF6缺失驱动的白血病表型是否依赖MYC。
对Traf6−/−;Tet2−/−与Tet2−/− HSPC使用MYC-Max二聚化抑制剂10058-F4或shMYC敲低，进行集落再形成；在嵌合小鼠中给予10058-F4并评估PB嵌合率。
TRAF6泛素化MYC的位点与连接链鉴定
确定TRAF6是否直接泛素化MYC及其关键位点和泛素连接类型。
在DOX诱导shTRAF6的TF-1细胞中进行定量泛素化蛋白组学；在HEK293细胞中转染WT或C70A TRAF6、WT或K148R MYC、WT或K63R泛素；用重组蛋白进行无细胞泛素化实验；免疫印迹Traf6−/−;Tet2−/− cKit+ BM细胞。
K148乙酰化对MYC活性的调控及体内验证
验证MYC K148乙酰化增强MYC转录活性和白血病生成。
构建MV4;11 K148R和K148Q基因编辑细胞，进行RNA-seq、MYC报告基因、WB及NSGS/NSG小鼠异种移植；在Tet2−/− cKit+ BM中过表达MYC(K148Q)并移植。
TLR-TRAF6激活抑制MYC功能的验证
确定TLR1/2激活TRAF6是否通过K148泛素化抑制MYC结合和靶基因表达。
用TLR1/2激动剂CU-T12–9处理MV4;11和HEL细胞，检测MYC泛素化、K148乙酰化、ChIP-seq MYC占据、MYC靶基因表达及细胞活力。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 10058-F4 | Sigma | F3680 |
| TLR1/2激活 | CU-T12-9 | Tocris Bioscience | 5414 |
| TRAF6与Tet2条件性敲除诱导 | 聚肌胞苷酸 | Tocris Bioscience | 4287 |
| 集落形成实验 | 甲基纤维素培养基 | Stem Cell Technologies | 03434 |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Fisher | SH30027.01 |
| DMEM培养基 | Fisher | SH30022FS | |
| 胎牛血清 | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| 青霉素/链霉素 | ThermoFisher | SV30010 | |
| IMDM培养基 | Corning | 10-016-CV | |
| 转染 | TransIT-LT1转染试剂 | Mirus | MIR2306 |
| 免疫印迹 | 硝酸纤维素膜 | Bio-Rad | 162-0112 |
| 免疫沉淀 | Protein A/G Plus琼脂糖珠 | Santa Cruz | sc-2003 |
| 基因编辑 | TrueCut Cas9蛋白v2 | Thermo Fisher | A36498 |
| 逆转录 | SuperScript II逆转录酶 | Invitrogen | 18064014 |
| qPCR | TaqMan通用PCR预混液 | Life Technologies | 4324018 |
| 体外泛素化 | 重组c-Myc（野生型） | Abcam | ab169901 |
| 重组TRAF6 | Life Sensors | UB312 | |
| 病毒感染 | 聚凝胺 | Millipore | TR-1003-G |
| 细胞筛选 | 嘌呤霉素 | Corning | 61-385-RA |
| 诱导敲低 | 多西环素 | Fisher Scientific | BP26535 |
| 逆转录 | High-Capacity cDNA逆转录试剂盒 | ThermoFisher | 4368814 |
| 骨髓预处理 | 5-氟尿嘧啶 | CCHMC pharmacy | NDC#63323-117-10 |
| 细胞筛选 | 杀稻瘟菌素 | Gibco | R21001 |
| 逆转录病毒感染 | RetroNectin | Takara | T100B |
| 流式分析 | FITC BrdU流式试剂盒 | BD Biosciences | 559619 |
| 细胞活力检测 | CellTiterGlo试剂盒 | Promega | G7570 |
| RNA提取 | Zymo Quick-RNA微量提取试剂盒 | Zymo Research | R1050 |
| 细胞核质分离 | 核提取试剂盒 | Active Motif | 40010 |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Pierce | 32106 |
| RNA提取 | RNeasy Plus微量试剂盒 | Qiagen | 74034 |
| RNA测序建库 | SMART-Seq v4超低起始量RNA测序建库试剂盒 | Takara Bio | 634899 |
| 泛素化蛋白组学 | PTMScan泛素残基基序试剂盒 | Cell Signaling Technology | 5562 |
| 体外泛素化 | 泛素化试剂盒 | Enzo Life Science | BML-UW9920 |
| 荧光素酶报告基因 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | E1910 |
| ChIP-seq建库 | ThruPLEX DNA测序建库试剂盒 | Takara | R400675 |
| ChIP | Dynabeads Protein G免疫沉淀磁珠 | Life Technologies | 10004D |
| 荧光素酶报告基因 | pGL4.70[hRluc]载体 | Promega | E688A |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体内RNAi筛选 | shRNA文库组成、每基因5–6条shRNA分4池、Tet2−/− cKit+细胞转导效率<8%、每池n=4小鼠、移植8×10^6 cKit+细胞中含500,000 dsRed+细胞 阅读提示：STAR Methods中In vivo RNAi screening小节及Figure 1A–E图注 |
| 竞争性骨髓移植与pIpC诱导 | 供体与CD45.1+竞争细胞比例、pIpC 1.5 mg/mL每只200 μL隔日5次、原代与二次移植时间点、每组n=5–6 阅读提示：STAR Methods中BM transplantation小节及Figure 2B–E图注 |
| 非竞争性骨髓移植与疾病监测 | 每受体1×10^6 CD45.2+ BM细胞、致死性照射、WT n=12、Traf6−/− n=25、Tet2−/− n=17、Traf6−/−;Tet2−/− n=23、约100天PB计数 阅读提示：STAR Methods中BM transplantation小节及Figure 3A–F图注 |
| MYC抑制剂体内实验 | 每受体5×10^5 BM细胞加5×10^5 CD45.1+竞争细胞、移植6周后10058-F4 2.5 mg/mL溶于玉米油加5% DMSO、20 mg/kg腹腔注射隔日3周 阅读提示：STAR Methods中BM transplantation小节及Figure 5G–I图注 |
| 体外泛素化与位点鉴定 | WT或K148R MYC、WT或C70A TRAF6、WT或K63R泛素、n=3独立实验、免疫沉淀后泛素化MYC占总MYC密度比值 阅读提示：STAR Methods中In Vitro ubiquitin conjugation reaction和Transfection小节及Figure 6B,C图注 |
| MV4;11基因编辑与异种移植 | K148R或K148Q编辑克隆、每受体5×10^5细胞尾静脉注射、亚致死照射250 rads、移植后3周BM人CD45+比例、WT n=5、K148R n=6 阅读提示：STAR Methods中Xenograft experiments和Cloning of MV4;11小节及Figure 6O–Q图注 |
| TLR1/2激动剂处理 | CU-T12–9浓度20 μM或10 μM、处理24小时、活力检测72小时、n=3独立生物学重复 阅读提示：STAR Methods中Reagents小节及Figure 7A–I图注 |