Hippo激酶缺失诱导肠道细胞重编程
探究LATS1/2或MST1/2缺失激活YAP后对肠道上皮细胞状态的影响。
使用Lrig1-CreERT2 Lats1fl/flLats2fl/fl小鼠和Villin-Cre或Villin-CreERT2 Mst1−/−Mst2fl/fl小鼠，进行scRNA-seq、组织学和RNA-ISH分析。
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通过Hippo信号传导对肠道干细胞状态进行再生重编程可抑制转移性结直肠癌
Regenerative Reprogramming of the Intestinal Stem Cell State via Hippo Signaling Suppresses Metastatic Colorectal Cancer.
实验完整度
高结合小鼠遗传模型、类器官、患者来源异种移植瘤及单细胞/批量RNA-seq，并有多层次功能与机制验证
主要模型
小鼠肠道类器官（包括Lats1/2 cKO、Mst1/2 cKO、Apc−/−、AKP、AKPS） 患者来源结直肠癌类器官及异种移植瘤 Lgr5-CreERT2谱系追踪小鼠 原位/皮下/脾内注射的NSG和裸鼠肿瘤模型
重点核对
Lats1/2 cKO小鼠在tamoxifen诱导后7天进行scRNA-seq及组织学分析（n=2/组） tetO-YAP S127A类器官用1 μg/mL doxycycline诱导48小时或指定时间后检测生长和标志物 Lats1/2 cKO类器官用100 nM 4-OHT过夜处理 AKP类器官原位移植后14天开始doxycycline饮水（2 mg/mL+0.5%蔗糖）诱导YAP5SA 二次移植中分选18,000个EpCAM+肿瘤细胞皮下注射裸鼠
摘要
虽然Hippo转录共激活因子YAP在许多组织中被认为是致癌的，但其在肠道稳态和结直肠癌（CRC）中的作用仍存在争议。在这里，我们证明抑制YAP活性的Hippo激酶LATS1/2和MST1/2是维持Wnt信号传导和经典干细胞功能所必需的。Hippo抑制诱导一种独特的上皮细胞状态，其特征是低Wnt信号传导、伤口愈合反应和转录因子Klf6表达。值得注意的是，LATS1/2缺失或YAP过表达足以将Lgr5+癌症干细胞重编程为该状态，从而在类器官、患者来源的异种移植瘤以及原发性和转移性CRC小鼠模型中抑制肿瘤生长。最后，我们证明YAP及其旁系同源物TAZ的基因缺失促进这些肿瘤的生长。总之，我们的结果确立了YAP在成人结肠中作为肿瘤抑制因子的作用，并表明Hippo激酶是结直肠恶性肿瘤的治疗脆弱点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- YAP在肠道稳态和结直肠癌中究竟发挥致癌还是抑癌作用，以及Hippo信号如何影响肠道干细胞状态和肿瘤生长。
- 核心机制
- Hippo激酶LATS1/2和MST1/2抑制YAP；YAP激活通过TEAD依赖的转录活性将Lgr5+肠干细胞和癌症干细胞重编程为低Wnt、Klf6+的伤口愈合样状态，从而抑制增殖和肿瘤生长。
- 主要证据
- 在Lats1/2或Mst1/2条件敲除小鼠、YAP过表达类器官、Apc−/−及AKP/AKPS类器官、患者来源类器官和异种移植瘤，以及原位、皮下和脾内注射小鼠模型中，YAP激活导致干细胞标志物和Wnt靶基因下调、Klf6上调、肿瘤生长抑制或消退；YAP/TAZ缺失则增加Apc突变结肠肿瘤负荷。
- 研究意义
- 研究确立YAP在成人结肠中作为肿瘤抑制因子，并提示Hippo激酶抑制剂可能作为治疗结直肠癌的潜在治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
YAP激活导致类器官生长停滞和干细胞特性丧失
验证YAP激活是否足以破坏类器官生长和经典干细胞功能。
使用tetO-YAPS127A rtTA结肠类器官和Lats1/2 cKO类器官，通过doxycycline或4-OHT诱导，观察生长、形态、RT-qPCR和组织学。
体内谱系追踪验证YAP激活损害干细胞功能
确定YAP激活的Lgr5+干细胞能否在体内贡献肠上皮谱系。
在Lgr5-IRES-CreERT2 Col1a1tetO-YapS127A/+Rosa26LSL-rtTA/LSL-Tomato小鼠中诱导YAP和tdTomato，进行谱系追踪。
黏膜损伤诱导YAP相关伤口愈合状态
验证生理性损伤是否诱导类似YAP激活的Wnt低、Klf6+状态。
采用结肠镜 punch biopsy 和3.5% DSS饮水两种损伤模型，进行组织学和scRNA-seq。
YAP在Wnt持续激活的Apc−/−类器官中仍能重编程
测试YAP能否在Apc缺失导致的Wnt持续激活背景下抑制干细胞程序。
在tetO-YAP rtTA类器官中通过CRISPR/Cas9引入Apc突变，并诱导YAP表达，进行生长观察、RT-qPCR和RNA-seq时间序列。
YAP激活抑制原发性结直肠癌生长
评估YAP激活对AKP三突变癌症类器官及体内肿瘤生长的影响。
在Apc−/−KrasG12Dp53−/−（AKP）类器官中诱导YAP5SA，进行体外生长、RNA-seq和原位/皮下移植。
YAP激活抑制肿瘤起始和转移能力
测试YAP激活对二次移植肿瘤起始和肝转移形成的影响。
二次移植分选的EpCAM+ AKP细胞；使用AKPS（Apc−/−KrasG12Dp53−/−Smad4−/−）类器官进行脾内注射。
YAP/TAZ缺失促进结肠肿瘤生长
在成年结肠中无偏测试Yap/Taz敲除对Apc突变肿瘤生长的影响。
向Apcfl/fl和Apcfl/flYapfl/flTazfl/fl小鼠结肠黏膜注射Ad-Cre，并采用AOM诱导散发性肿瘤。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 小鼠处理 | 他莫昔芬 | Sigma-Aldrich | T5648 |
| 玉米油 | Fisher Scientific | s93205 | |
| YAP诱导 | 多西环素盐酸盐 | Sigma-Aldrich | D9891 |
| 结肠炎诱导 | 葡聚糖硫酸钠盐 | MP Biomedicals | 0216011080 |
| 肿瘤诱导 | 氧化偶氮甲烷 | Sigma-Aldrich | A5486 |
| 类器官培养 | 基质胶 | Corning | CB-40234 |
| Advanced DMEM/F-12培养基 | Gibco | 12634028 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 26140079 | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | 25030164 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140163 | |
| N-2添加剂 | Gibco | 17502048 | |
| B-27添加剂（无维生素A） | Gibco | 12587010 | |
| HEPES溶液 | Amresco | J848 | |
| 重组鼠EGF | Peprotech | 315-09 | |
| Primocin抗生素 | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| N-乙酰-L-半胱氨酸 | Sigma-Aldrich | 9165 | |
| 重组鼠Noggin | Peprotech | 250-38 | |
| 烟酰胺 | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Lats1/2敲除诱导 | (Z)-4-羟基他莫昔芬 | Sigma-Aldrich | H7904 |
| Smad4敲除筛选 | 重组人TGF-β1 | Peprotech | 100-21 |
| 细胞筛选 | 杀稻瘟菌素 | InvivoGen | ant-bl-1 |
| AKP类器官筛选 | 吉非替尼 | ApexBio | A8219 |
| Nutlin-3 | ApexBio | A4228 | |
| 慢病毒转染 | TransIT-293转染试剂 | Mirus | MIR 2705 |
| 类器官传代 | Dispase酶 | STEMCELL Technologies | 07913 |
| 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25200114 | |
| 组织消化 | 胶原酶/Dispase | Roche | 10269638001 |
| 肿瘤消化 | IV型胶原酶 | Gibco | 17104019 |
| FACS缓冲液 | HBSS（10×） | Gibco | 14185052 |
| 组织消化 | EDTA溶液 | Amresco | E177 |
| 组织包埋 | HistoGel组织处理凝胶 | Thermo Fisher Scientific | NC9150318 |
| 免疫组化抗原修复 | 柠檬酸基抗原修复液 | Vector Laboratories | H-3300 |
| Tris基抗原修复液 | Vector Laboratories | H-3301 | |
| 免疫组化封闭 | 驴血清 | Sigma-Aldrich | D9663 |
| 免疫组化信号放大 | Vectastain Elite ABC HRP试剂 | Vector Laboratories | PK-7100 |
| 免疫组化复染 | 伊红Y酒精溶液 | Sigma-Aldrich | HT110332 |
| 免疫荧光 | DAPI | Invitrogen | D1306 |
| 免疫荧光封片 | ProLong Gold抗淬灭封片剂（含DAPI） | Invitrogen | P36935 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596018 |
| RT-qPCR | Fast SYBR Green预混液 | Applied Biosystems | 4385617 |
| 单细胞RNA-seq | InDrop单细胞RNA测序试剂盒 | 1CellBio | -- |
| 免疫组化显色 | DAB过氧化物酶底物试剂盒（含镍） | Vector Laboratories | SK-4100 |
| RNA原位杂交 | RNAscope 2.5 HD棕色试剂盒 | Advanced Cell Diagnostics | 322300 |
| RNAscope探针-Mm-AmotL2 | Advanced Cell Diagnostics | 515181 | |
| RNAscope探针-Mm-Lgr5 | Advanced Cell Diagnostics | 312171 | |
| RNAscope探针-Mm-Olfm4 | Advanced Cell Diagnostics | 311831 | |
| RNAscope探针-Mm-Axin2 | Advanced Cell Diagnostics | 400331 | |
| RNAscope探针-Mm-Reg4 | Advanced Cell Diagnostics | 409601 | |
| RNAscope探针-Mm-Klf6 | Advanced Cell Diagnostics | 426901 | |
| cDNA合成 | iScript cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | 1708891BUN |
| RNA提取 | NucleoSpin RNA XS试剂盒 | Takara Bio | 740902.50 |
| RNA-seq文库构建 | TruSeq RNA文库制备试剂盒v2 | Illumina | RS-122-2001 |
| 免疫组化 | 兔单克隆抗YAP抗体（克隆D8H1X） | Cell Signaling Technology | 14074 |
| 兔多克隆抗人溶菌酶抗体 | Dako | A0099 | |
| 兔单克隆抗Ki67抗体（克隆SP6） | GeneTex | GTX16667 | |
| 大鼠单克隆抗小鼠CD44抗体 | BD Biosciences | 550538 | |
| 山羊多克隆抗mCherry（tdTomato）抗体 | Sicgen | AB0040-200 | |
| 大鼠单克隆抗Ki67抗体（克隆SolA15） | Invitrogen | 14-5698-82 | |
| 兔单克隆非磷酸化（活性）β-catenin抗体（克隆D13A1） | Cell Signaling Technology | 8814 | |
| 兔单克隆抗磷酸化组蛋白H3（Ser10）抗体（克隆E173） | Millipore | 04-1093 | |
| Western blot | 兔单克隆抗HA标签抗体（克隆C29F4） | Cell Signaling Technology | 3724 |
| 兔单克隆抗GAPDH抗体（克隆14C10，HRP偶联） | Cell Signaling Technology | 3683 | |
| FACS | APC大鼠单克隆抗小鼠CD326（Ep-CAM）抗体 | BioLegend | 118214 |
| APC/Cy7大鼠单克隆抗小鼠TER-119抗体 | BioLegend | 116223 | |
| APC/Cy7大鼠抗小鼠CD45抗体（克隆30-F11） | BD Biosciences | 557659 | |
| APC/Cy7大鼠抗CD11b抗体（克隆M1/70） | BD Biosciences | 557657 | |
| 免疫组化 | 生物素化山羊抗兔IgG | Vector Laboratories | BA-1000 |
| 生物素化山羊抗大鼠IgG | Vector Laboratories | BA-9400 | |
| 免疫荧光 | 驴抗兔IgG，Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 |
| 驴抗大鼠IgG，Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21209 | |
| 结肠肿瘤诱导 | Ad5CMVCre-eGFP腺病毒 | University of Iowa - Viral Vector Core | VVC-U of Iowa-1174 |
| Ad5CMVCre腺病毒 | University of Iowa - Viral Vector Core | VVC-U of Iowa-5 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| Lats1/2 cKO小鼠单细胞RNA-seq | tamoxifen剂量2 mg腹腔注射，诱导后7天取材，每组2只小鼠 阅读提示：STAR Methods“Mice”小节；Figure 1A及图注 |
| YAP过表达类器官诱导 | doxycycline浓度1 μg/mL，诱导时间48小时或图注指定时间；4-OHT浓度100 nM过夜 阅读提示：STAR Methods“Mouse Colon Organoid Isolation and Culturing” |
| 体内YAP诱导（原位/皮下移植） | doxycycline饮水浓度2 mg/mL加0.5%蔗糖，开始给药时间（移植后14天或图注指定） 阅读提示：STAR Methods“Organoid transplantation experiments”；Figure 5F、5I图注 |
| AKPS脾内注射转移模型 | 注射细胞数300,000/100 μL，doxycycline体外诱导4天或体内饮水给药，5周后分析 阅读提示：STAR Methods“Intrasplenic Injection of Organoids”；Figure 6E-G图注 |
| Ad-Cre诱导结肠肿瘤 | 腺病毒滴度10^9 pfu/mL，每鼠3次注射，8周后分析 阅读提示：STAR Methods“Murine Colonoscopy and Mucosal Injection”；Figure 7A-B图注 |
| AOM诱导散发性肿瘤 | AOM剂量10 mg/kg腹腔注射，每周一次共6周，末次注射后2个月分析 阅读提示：STAR Methods“Azoxymethane-Induced Tumorigenesis”；Figure S7D-H图注 |