建立HNSCC小鼠模型并评估抗PD1联合顺铂对BMI1+ CSCs的影响
探究抗PD1联合顺铂能否清除HNSCC中的BMI1+ CSCs。
4NQO饮水16周诱导HNSCC，22周随机分组给予顺铂、抗PD1、抗PD1联合顺铂或IgG对照4周，处死前1天注射他莫昔芬标记Tomato+ BMI1+ CSCs，检测病变面积、组织学、凋亡、淋巴结转移、CD8+ T细胞浸润和Tomato+细胞比例。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
BMI1抑制可清除PD1阻断后残留的癌症干细胞，并激活抗肿瘤免疫以防止转移和复发
BMI1 Inhibition Eliminates Residual Cancer Stem Cells after PD1 Blockade and Activates Antitumor Immunity to Prevent Metastasis and Relapse.
实验完整度
高包含4NQO诱导小鼠HNSCC模型、体内谱系追踪、BMI1敲除小鼠、细胞系实验、RNA-seq及ChIP-qPCR机制验证
主要模型
4NQO诱导的Bmi1CreER;RosatdTomato小鼠HNSCC模型 K14CreER;Bmi1flox/flox小鼠HNSCC模型 人HNSCC细胞系SCC23和SCC1 人HNSCC石蜡包埋组织样本
重点核对
4NQO诱导16周后正常饮水，22周随机分组，他莫昔芬9 mg/40 g体重标记BMI1+ CSCs 抗PD1 200 μg/小鼠每周两次；顺铂5 mg/kg每周一次；PTC209 60 mg/kg每周两次；TAK779 150 μg/小鼠每周两次；抗CD8 100 μg/小鼠每周两次 体内谱系追踪：治疗4周后注射他莫昔芬，继续观察4周或8周评估复发 CD8+ T细胞清除和TAK779抑制趋化因子信号的功能挽救实验 ChIP-qPCR检测BMI1和H2AUb在CCL5、CXCL9、CXCL10、CXCL11启动子上的占据
摘要
基于PD-1阻断的联合治疗已被批准作为头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）的一线治疗。然而，应答率仍然相对较低，且HNSCC患者最终会复发。本研究发现，抗PD1与顺铂联合治疗在抑制HNSCC生长的同时，富集了HNSCC中的BMI1+ CSCs。相反，对BMI1的药理学和遗传学抑制可清除BMI1+ CSCs并使PD1阻断治疗成为可能，从而抑制转移性HNSCC并预防HNSCC复发。出乎意料的是，BMI1抑制除了清除BMI1+ CSCs外，还通过招募和激活CD8+ T细胞强烈诱导了肿瘤细胞内在的免疫应答。机制上，BMI1抑制通过刺激IRF3介导的转录和擦除抑制性H2A泛素化，诱导了招募CD8+ T细胞的趋化因子。我们的结果表明，靶向BMI1可能通过激活细胞内在免疫以及清除CSCs，使免疫检查点阻断能够抑制转移性肿瘤生长并预防肿瘤复发。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PD1阻断联合化疗能否清除HNSCC中的BMI1+ CSCs，以及靶向BMI1能否增强PD1阻断疗效并防止肿瘤复发和转移。
- 核心机制
- BMI1抑制通过诱导DNA损伤和胞质dsDNA积累激活cGAS-STING-IRF3通路，并通过擦除趋化因子启动子上的抑制性H2AUb标记，诱导CCL5、CXCL9、CXCL10和CXCL11表达，招募并激活CD8+ T细胞；同时BMI1抑制直接清除BMI1+ CSCs。
- 主要证据
- 在4NQO诱导的Bmi1CreER;RosatdTomato小鼠HNSCC模型中，抗PD1联合顺铂富集BMI1+ CSCs并最终复发；抗PD1联合PTC209或BMI1敲除清除BMI1+ CSCs、抑制肿瘤生长和淋巴结转移、增加CD8+ T细胞浸润；抗CD8抗体和TAK779逆转联合治疗的抗肿瘤免疫效应；RNA-seq、ELISA、Western blot和ChIP-qPCR证实cGAS-STING-IRF3通路激活及趋化因子启动子H2AUb擦除。
- 研究意义
- 研究提示靶向BMI1可能成为PD1阻断联合治疗的新策略，通过清除CSCs和激活肿瘤细胞内在免疫，有效抑制转移性肿瘤生长并预防复发。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估BMI1抑制剂PTC209联合抗PD1对BMI1+ CSCs和肿瘤进展的作用
验证靶向BMI1能否清除CSCs并增强PD1阻断疗效。
荷瘤Bmi1CreER;RosatdTomato小鼠给予抗PD1、PTC209、抗PD1联合PTC209或对照溶剂，检测病变面积、组织学、凋亡、淋巴结转移、CD8+ T细胞和GzmB+CD8+ T细胞浸润、Tomato+ BMI1+ CSCs和SOX2+细胞。
验证CD8+ T细胞在PTC209联合抗PD1抗肿瘤免疫中的必要性
确定肿瘤内CD8+ T细胞是否介导联合治疗的抗肿瘤免疫。
荷瘤小鼠同时给予抗CD8抗体清除CD8+ T细胞，检测CD8+ T细胞浸润、病变面积、HNSCC生长、凋亡和淋巴结转移。
验证上皮特异性BMI1敲除联合抗PD1的抗肿瘤和免疫效应
通过遗传学方法确认肿瘤细胞内在BMI1抑制与PD1阻断的协同作用。
K14CreER;Bmi1flox/flox与对照Bmi1flox/flox小鼠在4NQO处理后22周连续三次注射他莫昔芬诱导BMI1敲除，联合抗PD1治疗，检测病变面积、组织学、凋亡、淋巴结转移、CD8+ T细胞和GzmB+CD8+ T细胞浸润。
阐明BMI1抑制诱导趋化因子表达的分子和表观遗传机制
解析BMI1抑制如何招募CD8+ T细胞。
在SCC23和SCC1细胞中用shBMI1或PTC209抑制BMI1，进行RNA-seq、qRT-PCR、ELISA、免疫荧光、Western blot、碱性彗星实验、胞质dsDNA染色和ChIP-qPCR，检测DNA损伤、cGAS-STING-IRF3通路激活、趋化因子表达及启动子占据。
验证趋化因子信号在联合治疗抗肿瘤免疫中的必要性
确定IFN调节趋化因子和CD8+ T细胞招募对联合治疗疗效的必要性。
荷瘤小鼠同时给予TAK779抑制CCR5和CXCR3，检测CD8+ T细胞浸润、病变面积、HNSCC生长、凋亡和淋巴结转移。
评估BMI1抑制剂联合抗PD1对HNSCC复发的预防作用
确定清除BMI1+ CSCs能否预防HNSCC复发。
荷瘤Bmi1CreER;RosatdTomato小鼠接受抗PD1联合顺铂、抗PD1联合PTC209或对照溶剂治疗4周，随后他莫昔芬标记并追踪Tomato+细胞4周；另设延长治疗4周后观察8周复发的实验，检测病变面积、组织学、淋巴结转移和Tomato+ BMI1+ CSCs。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物处理 | 顺铂 | Sigma-Aldrich | 479306 |
| PTC209 | MedChem Express | HY-15888 | |
| TAK779 | Sigma-Aldrich | SML0911 | |
| 他莫昔芬 | Sigma-Aldrich | 5648 | |
| 抗体治疗 | 抗小鼠PD-1抗体 | Bio X Cell | BE0146 |
| 抗小鼠CD8a抗体 | Bio X Cell | BP0061 | |
| 大鼠IgG2a同型对照 | Bio X Cell | BE0089 | |
| 免疫荧光染色 | 兔多克隆抗广谱细胞角蛋白抗体 | Abcam | ab9377 |
| 兔抗切割型Caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9661 | |
| 兔单克隆抗CD8α抗体 | Cell Signaling Technology | 98941 | |
| 山羊多克隆抗颗粒酶B抗体 | R&D Systems | AF1865 | |
| 小鼠单克隆抗S100抗体 | Abcam | ab4066 | |
| 免疫组化 | 兔单克隆抗BMI1抗体 | Cell Signaling Technology | 5856 |
| 兔单克隆抗CD8α抗体 | Cell Signaling Technology | 85336 | |
| 兔多克隆抗CCL5抗体 | Abcam | ab9679 | |
| 小鼠单克隆抗CXCL10抗体 | Santa Cruz | sc-101500 | |
| Western blot | 兔单克隆抗磷酸化STING抗体 | Cell Signaling Technology | 19781 |
| 兔单克隆抗STING抗体 | Cell Signaling Technology | 13647 | |
| 兔单克隆抗磷酸化TBK1抗体 | Cell Signaling Technology | 5483 | |
| 兔单克隆抗TBK1抗体 | Cell Signaling Technology | 3504 | |
| 兔单克隆抗磷酸化IRF3抗体 | Cell Signaling Technology | 29047 | |
| 兔单克隆抗IRF3抗体 | Cell Signaling Technology | 4302 | |
| 兔单克隆抗泛素化组蛋白H2A抗体 | Cell Signaling Technology | 8240 | |
| 兔单克隆抗BMI1抗体 | Cell Signaling Technology | 6964 | |
| 兔单克隆抗磷酸化组蛋白H2A.X抗体 | Cell Signaling Technology | 9718 | |
| 兔单克隆抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 5174 | |
| 兔单克隆抗组蛋白H3抗体 | Cell Signaling Technology | 4499 | |
| 流式细胞术 | FITC标记抗CD3e单克隆抗体 | eBioscience | 11-0031 |
| APC标记抗CD4单克隆抗体 | eBioscience | 17-0041 | |
| PerCP-Cy5.5标记抗CD8单克隆抗体 | eBioscience | 45-0081 | |
| PE标记抗IFNγ单克隆抗体 | eBioscience | 12-7311 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | 11995065 |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | 10437028 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Thermo Fisher Scientific | R001100 | |
| 聚凝胺 | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| 嘌呤霉素 | Sigma-Aldrich | P9620 | |
| 质粒转染 | PLKO.1-shCtrl质粒 | Addgene | 1864 |
| PLKO.1-shBmi1质粒 | Sigma-Aldrich | N0000020156 | |
| psPAX2质粒 | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G质粒 | Addgene | 12259 | |
| qRT-PCR | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | 15596026 |
| M-MuLV逆转录酶 | New England Biolabs | M0253L | |
| 随机引物 | Thermo Fisher Scientific | 48190011 | |
| dNTP | Thermo Fisher Scientific | 18427013 | |
| ChIP-qPCR | Dynabeads蛋白A磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 10002D |
| ChIP DNA纯化浓缩试剂盒 | Zymo Research | D5205 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Sigma-Aldrich | R0278 |
| Halt蛋白酶抑制剂混合物 | Thermo Fisher Scientific | 78430 | |
| PhosSTOP磷酸酶抑制剂 | Sigma-Aldrich | 4906845001 | |
| Clarity Western ECL底物 | Bio-Rad | 1705060 | |
| ELISA | 人CCL5/RANTES Quantikine ELISA试剂盒 | R&D Systems | DRN00B |
| 人CXCL9/MIG Quantikine ELISA试剂盒 | R&D Systems | DCX900 | |
| 人CXCL10/IP-10 Quantikine ELISA试剂盒 | R&D Systems | DIP100 | |
| 人CXCL11/I-TAC Quantikine ELISA试剂盒 | R&D Systems | DCX110 | |
| 流式细胞术 | 固定/透化溶液试剂盒 | BD Biosciences | 554715 |
| 细胞刺激混合物(500X) | eBioscience | 00-4970 | |
| 胞质dsDNA染色 | Quant-iT PicoGreen双链DNA检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | P11496 |
| MitoTracker红色CMXRos线粒体染料 | Thermo Fisher Scientific | M7512 | |
| 免疫荧光染色 | DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 |
| SlowFade抗淬灭试剂 | Thermo Fisher Scientific | S36937 | |
| 彗星实验 | 彗星单细胞凝胶电泳检测试剂盒 | Enzo Life Sciences | ADI-900-166 |
| RNA-Seq | KAPA文库定量试剂盒 | KAPA Biosystems | 07960140001 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 4NQO诱导HNSCC小鼠模型 | 4NQO浓度50 μg/ml，饮水16周；小鼠周龄6周；品系Bmi1CreER;R26tdTomato或K14CreER;Bmi1flox/flox 阅读提示：Methods 'Mice'小节和'4NQO mouse model of HNSCC, treatment and histology'小节 |
| 体内药物治疗 | 顺铂5 mg/kg每周一次；抗PD1 200 μg/小鼠每周两次；PTC209 60 mg/kg每周两次；TAK779 150 μg/小鼠每周两次；抗CD8 100 μg/小鼠每周两次；治疗持续4周 阅读提示：Methods '4NQO mouse model of HNSCC, treatment and histology'小节 |
| 谱系追踪和BMI1敲除诱导 | 他莫昔芬9 mg/40 g体重腹腔注射；谱系追踪处死前1天注射；BMI1敲除连续三次注射 阅读提示：Methods 'Mice'小节和Figure 4A、Figure 7A图注 |
| 细胞系和shRNA敲低 | SCC23和SCC1细胞培养于含10% FBS和抗生素的DMEM；shBMI1感染后嘌呤霉素1 μg/ml筛选5天 阅读提示：Methods 'Cell lines'和'Cell culture and BMI1 knockdown by shRNA'小节 |
| ChIP-qPCR | 超声打断至200–500 bp；anti-BMI1和anti-H2AUb抗体4°C过夜免疫沉淀；数据以input DNA百分比表示 阅读提示：Methods 'qRT-PCR and ChIP-qPCR'小节 |