临床样本分析
检测OSA、动脉粥样硬化合并OSA患者及健康对照中外周血HMGB1和RAGE表达差异
收集外周血样本，ELISA检测血清HMGB1，Western blot检测白细胞中RAGE蛋白表达。
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慢性间歇性低氧诱导下高迁移率族蛋白B1/晚期糖基化终末产物受体/NOD样受体家族含 pyrin 结构域蛋白3轴的激活促进ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的进展
Activation of the High Mobility Group Box 1/Receptor for Advanced Glycation Endproducts /NOD-like Receptor Family Pyrin Domain-Containing 3 Axis Under Chronic Intermittent Hypoxia Induction Promotes the Progression of Atherosclerosis in ApoE-/- Mice
实验完整度
高包含临床患者样本、THP-1细胞与HUVEC细胞实验、ApoE-/-小鼠CIH模型等至少两个独立证据层级，并明确包含功能验证和机制验证。
主要模型
THP-1人单核细胞系 人脐静脉内皮细胞（HUVEC） CIH诱导的ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化模型 OSA患者及动脉粥样硬化合并OSA患者外周血样本
重点核对
CIH处理条件：O2浓度在0%和21%之间每30分钟循环，5% CO2，持续48小时 HMGB1抑制剂甘草酸（glycyrrhizin）浓度：20 μmol/L RAGE抑制剂FPS-ZM1浓度：1 μmol/L 小鼠造模：8周龄雄性ApoE-/-小鼠，高脂饮食，CIH处理1个月后给药，持续30天 细胞分组：明确了CIH、HMGB1、FPS-ZM1、glycyrrhizin及过表达NLRP3等处理组合
摘要
背景：慢性间歇性低氧（CIH）被认为是动脉粥样硬化疾病的重要病因。本研究旨在探讨CIH是否通过调节高迁移率族蛋白B1/晚期糖基化终末产物受体/NOD样受体家族含pyrin结构域蛋白3（HMGB1/RAGE/NLRP3）轴来影响动脉粥样硬化的进展。方法与结果：首先，收集单纯阻塞性睡眠呼吸暂停患者、动脉粥样硬化合并阻塞性睡眠呼吸暂停患者和健康志愿者的外周血样本。使用人单核细胞系THP-1和人脐静脉内皮细胞进行体外细胞实验，探讨HMGB1在细胞迁移、凋亡、黏附和跨内皮迁移中的作用。此外，建立CIH诱导的动脉粥样硬化小鼠模型，进一步确定HMGB1/RAGE/NLRP3轴在动脉粥样硬化中的关键作用。在动脉粥样硬化合并阻塞性睡眠呼吸暂停患者中观察到HMGB1和RAGE表达上调。CIH诱导通过抑制HMGB1甲基化增加HMGB1表达，激活RAGE/NLRP3轴。抑制HMGB1/RAGE/NLRP3轴后，单核细胞趋化和黏附受到抑制，巨噬细胞来源的泡沫细胞形成受到抑制，并伴有内皮细胞和泡沫细胞凋亡及炎症因子分泌受到抑制。体内动物实验也观察到，在CIH诱导的ApoE−/−小鼠中，抑制HMGB1/RAGE/NLRP3轴可阻止动脉粥样硬化的进展。结论：综上所述，CIH诱导通过抑制HMGB1甲基化上调HMGB1，进而激活RAGE/NLRP3轴促进炎症因子分泌，从而促进动脉粥样硬化的进展。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 慢性间歇性低氧（CIH）是否通过调节HMGB1/RAGE/NLRP3轴影响动脉粥样硬化的进展？
- 核心机制
- CIH通过抑制HMGB1启动子甲基化上调HMGB1表达，进而激活RAGE/NLRP3轴，促进炎症因子分泌，导致单核细胞趋化、黏附、跨内皮迁移以及泡沫细胞形成和凋亡，促进动脉粥样硬化进展。
- 主要证据
- 临床样本显示AS+OSA患者HMGB1和RAGE水平升高；CIH处理THP-1和HUVEC细胞抑制HMGB1甲基化并上调HMGB1、RAGE和NLRP3通路蛋白；CIH诱导的ApoE-/-小鼠中抑制HMGB1/RAGE轴减少脂质沉积和内皮凋亡，过表达NLRP3逆转glycyrrhizin的保护作用。
- 研究意义
- 本研究提出HMGB1/RAGE/NLRP3轴作为动脉粥样硬化潜在治疗靶点，HMGB1抑制剂glycyrrhizin可能具有抗动脉粥样硬化潜力，为动脉粥样硬化的治疗提供新方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外CIH细胞模型建立
探讨CIH对THP-1细胞和HUVECs中HMGB1表达及RAGE/NLRP3轴的影响
在Vivo 400低氧工作站中，将细胞暴露于间歇性低氧（O2在0-21%间每30分钟循环）48小时，并检测HMGB1甲基化、蛋白表达及下游通路。
机制验证
验证HMGB1对RAGE/NLRP3轴的激活作用及抑制剂的影响
使用HMGB1、FPS-ZM1、glycyrrhizin处理或过表达NLRP3，Western blot检测RAGE、NLRP3、pro-caspase-1、cleaved caspase-1、ASC等蛋白表达。
功能实验
评估HMGB1/RAGE/NLRP3轴对单核细胞趋化、黏附、跨内皮迁移及凋亡的影响
通过Transwell实验检测趋化，钙黄绿素标记检测黏附，跨内皮迁移实验评估迁移能力，流式细胞术检测细胞凋亡。
泡沫细胞形成检测
验证巨噬细胞来源泡沫细胞形成是否受HMGB1/RAGE/NLRP3轴调控
THP-1细胞经PMA诱导分化为巨噬细胞，用ox-LDL、CIH、HMGB1、glycyrrhizin或oe-NLRP3处理，油红O染色观察泡沫细胞形成。
体内动物实验
验证HMGB1/RAGE/NLRP3轴在CIH诱导的ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化进展中的作用
建立CIH诱导的ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化模型，给予glycyrrhizin、FPS-ZM1、oe-NLRP3等处理，检测主动脉脂质沉积、凋亡、巨噬细胞浸润等指标。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | BioWhittaker; Lonza | -- |
| 内皮生长培养基 | Clonetics | -- | |
| 细胞处理 | 佛波酯 | Sigma-Aldrich | -- |
| 细胞外HMGB1 | Absin Bioscience | abs04694 | |
| FPS-ZM1 | R&D Systems | 6237/10 | |
| 甘草酸 | MCE | HY-N0184 | |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| 低氧模型 | Vivo 400低氧工作站 | Biotrace | -- |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 甲基化检测 | Takara MiniBEST通用基因组DNA提取试剂盒5.0版 | Takara | -- |
| EpiTect快速亚硫酸氢盐转化试剂盒 | Qiagen | 59824 | |
| MeltDoctor高分辨率熔解试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 4425557 | |
| RT-qPCR | Trizol试剂 | Invitrogen | 15596026 |
| PrimeScript逆转录试剂盒 | Takara | RR047A | |
| FAST SYBR Green PCR试剂盒 | Applied Biosystems | -- | |
| ABI PRISM 7500实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Solarbio | R0010 |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Pierce | 23225 | |
| Trans-Blot Turbo转印系统 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| HMGB1一抗 | Abcam | ab18256 | |
| RAGE一抗 | Abcam | ab37647 | |
| NLRP3一抗 | Abcam | ab263899 | |
| ASC一抗 | Abcam | ab151700 | |
| pro-caspase-1一抗 | Abcam | ab179515 | |
| cleaved caspase-1一抗 | Cell Signaling Technologies | #98033 | |
| ICAM-1一抗 | Abcam | ab109361 | |
| MCP-1一抗 | Abcam | ab9669 | |
| CCR2一抗 | Cell Signaling Technologies | #12199 | |
| VCAM-1一抗 | Abcam | ab134047 | |
| β-actin一抗 | Abcam | ab8226 | |
| HRP标记兔抗鼠IgG | Abcam | ab6728 | |
| HRP标记山羊抗兔IgG | Abcam | ab6721 | |
| 增强化学发光试剂 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| Transwell | Transwell小室（孔径8 μm） | Costar | -- |
| 黏附实验 | 钙黄绿素-AM | Invitrogen | -- |
| 跨内皮迁移 | 大鼠尾胶原 | BD Biosciences | -- |
| ELISA | HMGB1 ELISA试剂盒 | IBL | REHM120 |
| IL-1β ELISA试剂盒 | R&D Systems | DY410 | |
| TNF-α ELISA试剂盒 | R&D Systems | DY410 | |
| 流式细胞术 | FACS Calibur流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| BD LSR II流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 凋亡检测 | Alexa Fluor 488 Annexin V/碘化丙啶凋亡检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 动物实验 | OxyCycle A84低氧系统 | BioSpherix | -- |
| ApoE基因敲除小鼠 | HFKBIO Co., Ltd. | -- | |
| 扫描电镜 | 扫描电子显微镜 | Hitachi | -- |
| 苏丹IV染色 | 正置金相显微镜 | Leica Biosystems | -- |
| 油红O染色 | 油红O | Sigma | -- |
| 异丙醇 | Sinopharm | -- | |
| 光学显微镜 | Olympus | -- | |
| 免疫荧光 | CD11b抗体 | Proteintech Group | -- |
| F4/80抗体 | Santa Cruz Biotechnology | -- | |
| FITC标记二抗 | Beyotime | -- | |
| Cy3标记二抗 | Beyotime | -- | |
| DAPI | Beyotime | -- | |
| TUNEL染色 | 蛋白酶K | 文中未明确说明 | -- |
| 统计分析 | SPSS 21.0统计软件 | IBM | -- |
| G power 3.1.9.7软件 | 文中未明确说明 | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本收集 | 患者诊断标准（OSA经多导睡眠监测，AS经冠脉造影等）、年龄、性别比例、样本量 阅读提示：Methods: Clinical Sample Collection |
| 细胞培养 | 培养基类型、血清浓度、培养条件（37°C，5% CO2）、细胞系来源 阅读提示：Methods: Cell Culture and Treatment |
| CIH细胞模型 | O2浓度循环（0-21%每30分钟）、处理时间（48小时）、CO2浓度（5%） 阅读提示：Methods: Construction of the In Vitro CIH Cell Model |
| 药物处理 | HMGB1浓度（50 ng/mL）、FPS-ZM1浓度（1 μmol/L）、glycyrrhizin浓度（20 μmol/L）、溶剂（ddH2O或DMSO）、处理时间（24小时） 阅读提示：Methods: Cell Culture and Treatment |
| 动物模型 | 小鼠品系（ApoE-/-，8周龄雄性）、饲养条件（高脂饮食，温度、湿度）、CIH循环参数（FiO2降至5-6%，每180秒循环，每日9am-9pm）、给药方案（glycyrrhizin 30 mg/kg腹腔注射，FPS-ZM1 1 mg/kg腹腔注射，oe-NLRP3 20 μg静脉注射，每天一次，持续30天） 阅读提示：Methods: Construction of a CIH Mouse Model and Animal Grouping |