样本采集与浸没固定
快速采集新鲜人脑活检组织和鼠脑样本并立即固定，以保持超微结构。
在人脑活检提取后≤60秒内转入含固定液的小瓶，随后转移至大体积固定液；鼠脑在安乐死后5分钟内采集并固定。固定液为2.5%戊二醛、2%多聚甲醛、2mM CaCl2、0.15M二甲胂酸钠缓冲液含3%甘露醇。
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用于基于电子显微镜的神经连接组学的人脑活检组织的多立方毫米体积的浸没固定和染色
Immersion Fixation and Staining of Multicubic Millimeter Volumes for Electron Microscopy-Based Connectomics of Human Brain Biopsies
实验完整度
高包含人体脑活检和鼠脑样本的浸没固定、重金属染色、超微结构评估及连接组学重建等多个实验层级，并验证了细胞外间隙、omega结构、膜断裂等特征。
主要模型
人脑皮层活检组织（来自深部脑刺激手术） 小鼠脑组织块
重点核对
固定液成分：2.5%戊二醛、2%多聚甲醛、2mM CaCl2、0.15M二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.4）含3%甘露醇（445 mOsm） 固定时间：人样本在<1分钟内浸入固定液，鼠样本在<5分钟内；固定持续时间：2 × 2 × 2 mm3块至少72小时，人活检样本3-28天 染色关键条件：OsO4第一步骤在室温下3小时，然后在4°C下8-12小时；第二步OsO4在4°C下5小时；乙酸铀酰在4°C下8-12小时（然后室温2小时） 样本体积：2 × 2 × 2 mm3或一个维度≤2mm的更大体积（最大37 mm3） 对照：经心灌注固定的小鼠样本用于比较细胞外间隙和omega图
摘要
连接组学可以在纳米尺度上映射约1立方毫米体积内的细胞及其回路。鉴于人类大脑皮层厚度可达3毫米，需要更大的体积。更大体积的人脑回路重建受到以下限制：1）新鲜活检组织的可用性；2）需要极好的超微结构保存，包括细胞外间隙；3）整个样品需要均匀染色，以及其他技术挑战。由于深部脑刺激的电极植入，神经外科患者的脑皮层样本可用。本文描述了一种浸没固定、重金属染色和组织处理方法，该方法可一致地提供人和啮齿动物手术脑样本（体积为2 × 2 × 2立方毫米，以及体积达37立方毫米且至少一个维度≤2毫米）的极好的超微结构。该方法应允许对患有精神和神经疾病的患者的样本进行突触水平回路分析。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何为基于电子显微镜的人脑活检组织提供极好的超微结构保存和均匀染色，以支持大体积连接组学研究。
- 核心机制
- 文中未明确说明。
- 主要证据
- 研究通过人脑活检组织和鼠脑样本的浸没固定、重染和电子显微镜成像，显示细胞外间隙维持在12-20%左右，与灌注固定相比，omega结构显著增多，并成功进行了手动和自动分割、突触和轴突重建。
- 研究意义
- 该方法应允许对患有精神和神经疾病的患者的样本进行突触级回路分析。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
重金属染色
确保在整个大体积样本中均匀染色，增强膜对比度，同时避免组织裂纹和脆性。
经过缓冲液洗涤后，进行两步OsO4处理（室温3小时，随后4°C 8-12小时）、铁氰化钾还原、TCH处理、第二次OsO4染色、乙酸铀酰染色。
脱水和树脂包埋
将染色的样本准备用于超薄切片和电子显微镜检查。
使用梯度乙腈脱水，然后浸入LX-112树脂，最后包埋并在45°C 4小时和60°C 68小时固化。
电子显微镜成像和分割
评估固定和染色质量，并测试是否可以进行神经回路重建。
收集30nm连续切片，使用低分辨率EM和多束扫描EM成像，然后进行图像拼接、对齐和手动/自动分割。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 固定 | 氯化钙1M | Sigma-Aldrich | 21115 |
| D-甘露醇 | Sigma-Aldrich | M4125 | |
| 染色 | 硫代卡巴肼 | Electron Microscopy Sciences | 21900 |
| 2%乙酸铀酰 | Electron Microscopy Sciences | 22400 | |
| 脱水 | 蒸馏水（超纯水） | Invitrogen | 10977023 |
| 树脂包埋 | 壬烯基琥珀酸酐 | Electron Microscopy Sciences | 19050 |
| LX-112树脂套件（含BDMA） | LADD Research Industries | 21212 | |
| 缓冲液 | 0.9%氯化钠溶液 | Sigma-Aldrich | S8776 |
| 乳酸林格氏液 | B Braun Medical Inc | BMGL7500 | |
| 组织采集 | 活检穿孔器 | Ted Pella, Inc. USA | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 浸没固定 | 固定液成分、温度（4°C）、体积、固定时间（人<1分钟转移，鼠<5分钟；固定持续时间人3-28天，鼠72小时） 阅读提示：Methods和表1 |
| 重金属染色 | 各步骤的试剂浓度、时间、温度（如OsO4第一步室温3小时然后4°C 8-12小时，TCH室温45分钟，乙酸铀酰4°C 8-12小时和室温2小时） 阅读提示：Methods和表1 |
| 脱水和树脂包埋 | 乙腈梯度浓度和时间、树脂浸透时间、固化温度和时间 阅读提示：表1 |
| EM成像与分割 | 切片厚度（30 nm）、成像方法（多束扫描EM）、分割方法（手动/自动） 阅读提示：Methods和补充方法 |