无病毒CRISPR-CAR T细胞的生产、表征及其诱导实体瘤消退的能力

**背景**：嵌合抗原受体（CAR）T细胞在治疗血液系统恶性肿瘤（如CD19阳性癌症）中已展现出较高的临床应答率，但在实体瘤患者中疗效有限。近期研究表明，在CD19 CAR的背景下，将CAR精确插入特定基因位点可改善治疗效果；然而，此类策略是否也能影响实体瘤的疗效尚不明确。此外，CAR的制造通常依赖于病毒载体进行基因递送，这是生产供应链中复杂且资源密集的环节。**方法**：使用CRISPR/Cas9系统，在无需任何病毒载体的条件下，通过重组Cas9蛋白和核酸在9天内生成抗GD2 CAR T细胞。CAR被特异性靶向整合至T细胞受体α恒定区基因（TRAC）位点。分别采用CHANGE-seq、靶向二代测序、单细胞RNA测序、光谱流式细胞术和ELISA检测，在基因组、转录组、蛋白质组和分泌组水平对T细胞产品进行表征。在NSG™异种移植神经母细胞瘤模型中评估其体内功能。**结果**：与逆转录病毒CAR T细胞相比，无病毒CRISPR CAR（VFC-CAR）T细胞表现出CAR转基因在TRAC位点的靶向基因组整合、与记忆样表型相关的转录和蛋白特征上调，以及输注前较低的强直性信号（部分源于T细胞受体的敲除）。在接触GD2靶抗原后，抗GD2 VFC-CAR T细胞在体外对GD2阳性细胞表现出特异性细胞毒性，并在体内诱导实体瘤消退。相对于逆转录病毒CAR T细胞，VFC-CAR T细胞在人神经母细胞瘤异种移植模型中显示出更强的归巢与持久性，且衰竭程度降低。**结论**：本研究利用无病毒基因组编辑技术，成功制备了具有TRAC靶向CAR的CAR T细胞，这可为包括实体瘤在内的癌症治疗用CAR T细胞的生产提供参考。