鉴定EGLN2与组蛋白H3的结合
探究EGLN2是否直接结合组蛋白H3及其具体位点。
通过免疫沉淀、GST pull-down和生物素化肽段pull-down实验检测EGLN2与H3的结合，并突变H3脯氨酸残基确定结合位点。
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组蛋白H3脯氨酸16羟基化调控哺乳动物基因表达
Histone H3 proline 16 hydroxylation regulates mammalian gene expression
实验完整度
高包含体外生化实验、细胞功能实验、全基因组CUT&RUN和RNA-seq、动物及患者样本分析等多个独立证据层级，并有功能验证和机制验证。
主要模型
MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞系 293T人胚肾细胞系 EGLN2敲除小鼠 三阴性乳腺癌患者配对样本
重点核对
EGLN2对H3P16oh的催化活性及H358A突变对催化活性的影响 H3P16oh对KDM5A与H3K4me3结合增强的效应 EGLN2敲低或缺氧处理对H3P16oh、H3K4me3及靶基因表达的影响 KDM5A KKQ3A突变对H3K4me3去甲基化功能的影响
摘要
组蛋白翻译后修饰(PTMs)对于调控多种DNA模板化过程至关重要。在此，我们报道了哺乳动物细胞中存在一种组蛋白PTM，即组蛋白H3第16位脯氨酸的羟基化(H3P16oh)，由脯氨酰羟化酶EGLN2催化。我们证明H3P16oh增强KDM5A与其底物组蛋白H3赖氨酸4三甲基化(H3K4me3)的直接结合，导致KDM5A在染色质上的招募增强，相应靶基因处H3K4me3水平降低。全基因组和全转录组分析表明，EGLN2-KDM5A轴调控哺乳动物细胞中靶基因的表达。具体来说，我们的数据证明通过EGLN2-H3P16oh-KDM5A通路抑制WNT通路负调控因子DKK1，从而促进三阴性乳腺癌(TNBC)中的WNT/β-catenin信号。这项研究表征了“组蛋白密码”中的一个调控标记，并揭示了H3P16oh在调控哺乳动物基因表达中的作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 组蛋白H3脯氨酸16羟基化是否作为新型组蛋白翻译后修饰调控哺乳动物基因表达。
- 核心机制
- EGLN2催化H3P16oh，增强KDM5A对H3K4me3的识别，促进KDM5A招募至染色质，降低H3K4me3水平，从而调控靶基因表达。
- 主要证据
- 体外羟基化实验、质谱鉴定、CUT&RUN和RNA-seq显示EGLN2-H3P16oh-KDM5A轴调控基因表达；在MDA-MB-231细胞中证明该通路抑制DKK1表达，激活WNT/β-catenin信号。
- 研究意义
- 首次鉴定H3P16oh为组蛋白密码的调控标记，揭示其在哺乳动物基因表达及三阴性乳腺癌中WNT通路调控中的功能。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证EGLN2催化H3P16oh
确认EGLN2是否催化组蛋白H3第16位脯氨酸的羟基化。
通过泛羟基脯氨酸抗体免疫沉淀、体外羟基化实验、质谱分析及H3P16oh特异性抗体检测，验证EGLN2催化的H3P16oh。
研究H3P16oh对H3K4me3的调控
探究H3P16oh是否影响组蛋白H3K4me3水平。
通过免疫印迹检测EGLN2敲低或过表达后H3K4me3变化，及H3P16A突变对H3K4me3的影响。
揭示H3P16oh增强KDM5A招募的分子机制
阐明H3P16oh如何促进KDM5A与H3K4me3结合。
通过pull-down、ITC、NMR和突变分析，鉴定KDM5A PHD3结构域中识别H3P16oh的关键残基。
全基因组分析EGLN2-H3P16oh-KDM5A轴的功能
鉴定受该信号轴调控的基因组区域和靶基因。
通过CUT&RUN和RNA-seq分析MDA-MB-231和293T细胞中H3P16oh、KDM5A、H3K4me3的分布及EGLN2敲低后的表达变化。
体内验证与病理生理相关性
验证H3P16oh在动物模型和患者样本中的调控作用。
检测EGLN2敲除小鼠各组织中H3P16oh和H3K4me3水平，以及三阴性乳腺癌患者肿瘤中EGLN2和H3P16oh的表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | 11965118 |
| RPMI 1640培养基 | Gibco | 11875093 | |
| 乳腺上皮生长培养基 | Lonza | CC-3151 | |
| SingleQuots添加剂 | Lonza | CC-4136 | |
| HuMEC即用培养基 | Gibco | 12752-010 | |
| 支原体检测试剂盒 | Lonza | LT07-218 | |
| 药物处理 | DMOG | Frontier Scientific | D1070-1g |
| DFO | Sigma | D9533-1G | |
| FG4592 | Sigma | D9533-1G | |
| Western blot | 罗氏完全蛋白酶抑制剂 | Roche | -- |
| 磷酸酶抑制剂 | Roche | -- | |
| 硝酸纤维素膜 | Millipore | -- | |
| Laemmli上样缓冲液 | BIO-RAD | 1610737 | |
| H3P16oh抗体 | Abclonal | -- | |
| 质粒构建 | Quick Change XL定点突变试剂盒 | Agilent Technologies | 200516 |
| 蛋白制备 | 重组FLAG-EGLN1/2/3蛋白 | Active Motif | 81065, |
| 核心组蛋白 | Active Motif | 53501 | |
| 重组组蛋白H3.1 | Active Motif | 31294 | |
| 重组组蛋白FLAG-KDM5A蛋白 | Active Motif | 31431 | |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo | L3000150 |
| Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Thermo | 13778150 | |
| 免疫沉淀 | 抗FLAG M2亲和凝胶 | Sigma | A2220 |
| 抗c-Myc琼脂糖 | Sigma | A7470-1mL | |
| 蛋白G琼脂糖珠 | Roche Applied Bioscience | 11243233001 | |
| 拉下实验 | NeutrAvidin琼脂糖树脂 | Thermo | 29200 |
| 体外羟基化 | 重组EGLN2 | Active motif | 81764 |
| his-tag蛋白纯化 | 镍柱 | Qiagen | 30250 |
| HiTrap Q离子交换柱 | GE Healthcare | -- | |
| Superdex 75 10/300凝胶过滤柱 | GE Healthcare | -- | |
| AKTA蛋白纯化系统 | GE Healthcare | -- | |
| ITC | 微量热等温滴定量热仪MicroCal Auto-iTC200 | Malvern | -- |
| 质谱分析 | Fusion Lumos质谱仪 | Thermo Fisher | -- |
| 定量质谱 | Q-Exactive HF-X质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Easy nanoLC 1200液相色谱 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| nanoEase MZ HSS T3色谱柱 | Waters | -- | |
| 细胞增殖实验 | MTS试剂 | Promega | G3580 |
| NMR | 600 MHz Agilent DD2核磁共振波谱仪 | Agilent | -- |
| Bruker Avance III 700 MHz和850 MHz核磁共振波谱仪 | Bruker | -- | |
| CUT&RUN | 伴刀豆蛋白A磁珠 | Bangs Laboratories | BP531 |
| pAG-微球菌核酸酶 | EpiCypher | 15-1116 | |
| NEB DNA纯化试剂盒 | NEB | T1030 | |
| NEBNext Ultra II DNA文库制备试剂盒 | NEB | -- | |
| KDM5A抗体 | Abcam | ab70892 | |
| H3K4me3抗体 | EpiCypher | 15-1016 | |
| EGLN2抗体 | Abcam | ab113077 | |
| IgG抗体 | Cell Signaling | 2729 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源和培养条件，包括培养基、血清浓度、抗生素等 阅读提示：Methods部分Cell Culture and drug treatment |
| 外源表达 | 质粒构建和转染方法，转染试剂和用量 阅读提示：Methods部分Plasmids, Proteins and Peptides和Transfection, Virus Production and Infection |
| 体外羟基化 | 反应体系组成（缓冲液、辅因子浓度）、反应时间和温度 阅读提示：Methods部分In vitro hydroxylation assay |
| CUT&RUN | 细胞数量、抗体稀释比例、孵育时间、MNase浓度和处理时间 阅读提示：Methods部分Cleavage Under Targets & Release Using Nuclease (CUT&RUN) |