患者匹配活检的遗传学分析
鉴定KRAS/EGFR抑制剂治疗后的获得性遗传耐药事件及其克隆性
对12例CRC患者治疗前、治疗中及进展后活检（含ctDNA）进行MSK-IMPACT靶向外显子测序，比较肿瘤与匹配正常样本，注释驱动变异并评估变异等位基因频率
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结直肠癌中KRAS抑制的遗传性与非遗传性耐药机制的共存
Concurrent genetic and non-genetic resistance mechanisms to KRAS inhibition in colorectal cancer.
实验完整度
高患者匹配活检外显子测序与空间转录组、人鼠类器官模型、体内移植瘤模型，含功能与机制验证
主要模型
12例CRC患者匹配活检（治疗前、治疗中、进展后） AKP-G12C小鼠结肠类器官及移植瘤（C57Bl/6与NSG小鼠） KRASG12C突变CRC患者来源类器官（PDO） HCT116结直肠癌细胞系
重点核对
患者队列：12例CRC患者，治疗前活检n=11、治疗中（第7–21天）n=11、进展后n=8；5例部分缓解、7例疾病稳定 联合方案：sotorasib+panitumumab或adagrasib±cetuximab，除1例外均接受KRASG12C+EGFR联合抑制 AKP-G12C类器官耐药诱导：adagrasib 100 nM或adagrasib+afatinib（50/5 nM）持续处理10–12周（部分实验4–12周），EC50偏移25–100倍 TBK1敲低验证：doxycycline诱导shTbk1（1 μg/mL）联合adagrasib 50 nM处理7天 小鼠移植瘤给药：adagrasib 50 mg/kg口服灌胃，每日一次（5天给药2天停药），共30天
摘要
KRAS在45%–50%的结直肠癌（CRC）病例中发生突变激活，尽管KRAS靶向疗法已显示出临床前景，但耐药性限制了其疗效。为探索KRAS抑制剂耐药的机制，我们对接受KRASG12C和EGFR抑制剂联合治疗的患者匹配CRC活检样本进行了靶向外显子组测序和空间转录组学分析。我们发现，大多数患者在疾病进展时存在获得性遗传事件，但这些事件通常是亚克隆的，并与转录适应性状态共存。间质性、YAP和胎儿样转录特征在耐药肿瘤中占主导地位，而炎症程序在治疗早期即被诱导。单细胞空间分析揭示了肿瘤内异质性，单个肿瘤的不同区域存在多种适应性状态。利用人类和小鼠类器官模型，我们证明药物诱导的炎症程序至少部分为癌细胞自主性，并先于耐药性的出现。我们将TBK1确定为可消除炎症适应期并增强对KRAS抑制反应的靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- KRAS抑制剂在结直肠癌中的原发性和获得性耐药机制是什么，遗传性与非遗传性适应如何共存并影响治疗反应。
- 核心机制
- KRAS抑制后癌细胞早期诱导TBK1-IRF3驱动的炎症程序，随后耐药肿瘤出现YAP、胎儿样和间质性转录适应，并与RAS-MAPK再激活等遗传事件共存；TBK1抑制可阻断早期炎症适应并增强KRAS抑制疗效。
- 主要证据
- 患者匹配活检的MSK-IMPACT外显子测序和CosMx空间转录组显示获得性遗传事件多为亚克隆，耐药活检中YAP/胎儿样/EMT程序富集且存在瘤内异质性；AKP-G12C类器官和PDO实验显示炎症程序为癌细胞自主性并先于耐药出现，TBK1抑制剂或shTbk1敲低与adagrasib协同抑制生长。
- 研究意义
- 揭示KRAS抑制耐药中遗传与非遗传机制的复杂共存及瘤内异质性，提示靶向早期炎症适应（如TBK1）可能为实现更深入持久的RAS靶向治疗反应提供策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
空间转录组学解析肿瘤适应性状态
识别KRAS抑制后肿瘤细胞的转录程序适应及空间分布
对30份FFPE组织切片进行CosMx 950基因空间转录组检测，质控后679,588个细胞（含375,985个癌细胞）进行无监督聚类、差异表达、UCell通路评分和空间可视化
多重免疫荧光验证免疫亚群变化
补充CosMx对免疫群体分辨率的不足，验证治疗前后免疫细胞丰度变化
对部分样本FFPE切片进行6-plex mIF，标记panCK、CD4、CD8、FOXP3、CD68、CD163，定量细胞密度并进行时间点比较
类器官模型建立与耐药诱导
在无肿瘤微环境条件下功能性地研究KRAS抑制的反应与耐药
构建携带Apc截短、KrasG12C和Trp53截短的AKP-G12C小鼠结肠类器官，以及患者来源类器官PDO，持续给予adagrasib或adagrasib+afatinib诱导耐药，并通过Incucyte实时监测类器官面积
体内移植瘤模型验证免疫依赖性
评估adagrasib反应和耐药是否依赖免疫细胞
将AKP-G12C类器官皮下移植至免疫健全C57Bl/6和免疫缺陷NSG小鼠，随机分组给予vehicle或adagrasib，监测肿瘤生长
转录组分析揭示炎症适应程序
比较治疗前、治疗中和耐药类器官的转录程序，验证患者活检中的发现
对AKP-G12C类器官在adagrasib（100 nM）或adagrasib/afatinib（50/5 nM）处理72小时及耐药后进行RNA-seq，进行差异表达、GSVA、fgsea和ORA分析
TBK1靶向验证与联合处理
检验抑制TBK1是否阻断早期炎症程序并增强KRAS抑制疗效
在PDO中进行聚焦药物筛选（8种激酶抑制剂各两个浓度），并用TBK1/IKKε-IN-5、momelotinib及doxycycline诱导shTbk1敲低联合adagrasib处理类器官，Western blot检测pTBK1和pIRF3，CellTiter-Glo检测活力
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | Corning | 10-013-CV |
| RPMI 1640培养基 | Corning | 10-040-CV | |
| 胎牛血清 | Gibco | A5670801 | |
| 青霉素/链霉素 | Fisher Scientific | 15140163 | |
| 类器官培养 | DMEM/F12培养基 | Gibco | 12634028 |
| GlutaMAX添加剂 | Gibco | 35050061 | |
| HEPES缓冲液 | Corning | 25-060-Cl | |
| N-乙酰半胱氨酸 | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| 烟酰胺 | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| 表皮生长因子 | PeproTech | AF-100-15 | |
| 成纤维细胞生长因子10 | PeproTech | 100–26 | |
| WNT替代物-Fc融合蛋白 | ImmunoPrecise Antibodies | N-001 | |
| Y-27632 | MedChemExpress | HY-10071 | |
| A-83-01 | MedChemExpress | HY-10432 | |
| SB202190 | MedChemExpress | HY-10295 | |
| LDN193189 | MedChemExpress | HY-12071 | |
| 胃泌素-I | MedChemExpress | HY-P2671 | |
| B27添加剂 | Gibco | 17504044 | |
| Fungin抗真菌剂 | InvivoGen | ant-fn-1 | |
| Primocin抗菌剂 | InvivoGen | ant-pm-05 | |
| 基质胶 | Corning | 353224 | |
| 组织消化 | III型胶原酶 | Worthington | 9001-12-1 |
| 中性蛋白酶 | Sigma-Aldrich | D4818 | |
| 药物处理 | 阿达格拉西布 | MedChemExpress | HY-130149 |
| 阿法替尼 | MedChemExpress | HY-10261 | |
| RMC-7977 | MedChemExpress | HY-148439 | |
| TBK1/IKKε抑制剂-5 | MedChemExpress | HY-128679 | |
| 莫美洛替尼 | MedChemExpress | HY-10961 | |
| GSK8612 | MedChemExpress | HY-111941 | |
| 阿培利司 | MedChemExpress | HY-15244 | |
| 地法替尼 | MedChemExpress | HY-12289 | |
| TPCA-1 | MedChemExpress | HY-10074 | |
| 培西达替尼 | MedChemExpress | HY-16749 | |
| SP600125 | MedChemExpress | HY-12041 | |
| LY2157299 | MedChemExpress | HY-13226 | |
| Western blot | 磷酸化p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204)抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 |
| p44/42 MAPK (Erk1/2)抗体 | Cell Signaling Technology | 9107 | |
| 磷酸化TBK1/NAK1 (Ser172)抗体 | Cell Signaling Technology | 5483 | |
| TBK1抗体 | Cell Signaling Technology | 3504 | |
| 非磷酸化（活性）Yap (Ser127)抗体 | Cell Signaling Technology | 29495 | |
| Yap抗体 | Cell Signaling Technology | 12395 | |
| 磷酸化IRF3 (Ser396)抗体 | Cell Signaling Technology | 4947 | |
| β-肌动蛋白HRP偶联抗体 | Cell Signaling Technology | 12262 | |
| Vinculin HRP偶联抗体 | Cell Signaling Technology | 18799 | |
| 细胞回收液 | Corning | 354253 | |
| DC蛋白检测试剂盒 | BioRad | 5000116 | |
| 多重免疫荧光 | CD4抗体 | Ventana | 790–4423 |
| CD8抗体 | Ventana | 790–4460 | |
| FOXP3抗体 | Abcam | ab20034 | |
| CD68抗体 | DAKO | M0814 | |
| CD163抗体 | Invitrogen | MA1-82342 | |
| 泛细胞角蛋白抗体 | Abcam | ab8068 | |
| Leica Bond聚合物抗兔HRP | Leica | DS9800 | |
| 兔抗小鼠二抗 | Abcam | ab133469 | |
| Alexa Fluor酪胺信号放大试剂 | Life Technologies | B40953 | |
| CF染料酪胺偶联物 | Biotium | 92172 | |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Glo 3D细胞活力检测试剂盒 | Promega | G9681 |
| 拷贝数检测 | TaqMan拷贝数检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 4400291 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596–026 |
| DNase I | Roche Diagnostics | 04716728001 | |
| Qiagen RNeasy微型试剂盒 | Qiagen | 74106 | |
| DNA提取 | Qiagen DNeasy组织试剂盒 | Qiagen | 69504 |
| EZ1 Advanced XL系统 | Qiagen | 9018702 | |
| 文库构建 | KAPA HTP文库构建试剂盒 | Kapa Biosystems | KK2611 |
| 克隆重构建 | EcoRI-HF限制酶 | New England Biolabs | R3101L |
| XhoI限制酶 | New England Biolabs | R0146L | |
| 慢病毒包装 | 聚乙烯亚胺 | Sigma-Aldrich | 408727 |
| psPax2包装质粒 | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G包膜质粒 | Addgene | 12259 | |
| 类器官生长监测 | Incucyte S3活细胞分析系统 | Sartorius | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者样本采集与测序 | 治疗前、治疗中（第7–21天）及进展后活检的时间点、样本量（11/11/8）及测序方法（MSK-IMPACT、MSK-ACCESS cfDNA） 阅读提示：Results第一部分及Figure 1A、1B；STAR Methods中Patients与cfDNA分析、Patient tissue exome sequencing小节 |
| 空间转录组分析 | CosMx 950基因panel、FFPE切片厚度（5 μm）、细胞质控阈值（≥100转录本）及差异表达阈值（log2FC>0.3，adj p<0.05） 阅读提示：STAR Methods中Spatial transcriptomics与Data import、quality control、preprocessing小节；Figure 1B图注 |
| 类器官耐药模型建立 | AKP-G12C类器官基因工程背景（Apc Q1405X、KrasG12C、Trp53 Q97X）、耐药诱导药物浓度（adagrasib 100 nM或adagrasib+afatinib 50/5 nM）及诱导时间（10–12周，部分4–12周） 阅读提示：STAR Methods中Murine colon cancer organoids与Organoid growth experiments小节；Figure 4B–4F图注 |
| 小鼠移植瘤实验 | 移植细胞数（约200,000）、Matrigel比例（50%）、随机化肿瘤体积（100 mm³）、adagrasib剂量（50 mg/kg）及给药方案（每日口服，5天给药2天停药，30天） 阅读提示：STAR Methods中Animal models and mouse tumor treatments小节；Figure S9A、S9B图注 |
| TBK1靶向联合处理 | TBK1/IKKε-IN-5与momelotinib浓度（1 μM）、adagrasib浓度（50 nM）、shTbk1诱导条件（doxycycline 1 μg/mL，7天）及检测终点（类器官面积、CTG活力、pTBK1/pIRF3蛋白水平） 阅读提示：STAR Methods中Organoid growth experiments与Western Blot小节；Figure 5A–5C、5H–5K图注 |