建立CP与CPC的基因共表达图网络并计算上下文漂移
识别CP向CPC转化过程中基因共表达上下文的变化，预测肿瘤发生的驱动基因。
对小鼠CP和CPC的scRNA-seq数据用RECODR构建共表达图网络，通过Node2Vec和Word2Vec学习基因上下文，计算上下文漂移评分，并与WGCNA、diffcoexp和scDRUG比较。
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基因上下文漂移识别可缓解癌症治疗耐药的药物靶点
Gene context drift identifies drug targets to mitigate cancer treatment resistance.
实验完整度
高包含小鼠CPC模型、患者scRNA-seq及空间转录组，并通过shRNA筛选、药物试验和FISH等功能验证。
主要模型
TP53突变型脉络丛癌小鼠模型（mCPC） 人脉络丛癌单核RNA-seq样本 人髓母细胞瘤配对scRNA-seq样本 人三阴性乳腺癌配对snRNA-seq样本（PARTNER试验）
重点核对
CPC细胞经FACS分选YFP+/RFP+后用于scRNA-seq，并通过染色体拷贝数变异和核型分析验证 AZD1390口服灌胃20 mg/kg，Dasatinib 25 mg/kg，AZD9574 3 mg/kg，每日给药 放疗：植入部位20 Gy，2 Gy/天，5天照射/2天休息循环 shRNA敲低227个DNA修复基因后测定CPC克隆形成，72–120小时 小鼠随机分组样本量：Regimen A-G共65只，Dasatinib试验36只
摘要
癌症治疗常因不同疗法组合引发难以预测的复杂耐药机制而失败。我们提出RECODR（通过上下文漂移识别耐药）：一种计算流程，它将单细胞RNA测序图谱的共表达图网络与图嵌入方法相结合，以测量癌症治疗过程中基因共表达上下文的变化。RECODR基于这样的理念：基因共表达上下文而非仅表达水平，揭示了关于治疗耐药的重要信息。使用RECODR分析临床前和临床试验中治疗的肿瘤，揭示了现有计算方法无法看到的耐药机制，从而能够为脉络丛癌小鼠设计高效的联合治疗，并为髓母细胞瘤和三阴性乳腺癌患者预测潜在的新疗法。因此，RECODR可能通过检测决定耐药表型的基因相互作用的上下文特异性变化，来揭示癌症治疗耐药的复杂性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否通过检测癌症治疗过程中基因共表达上下文的变化来识别驱动耐药的靶点，并据此设计有效的联合治疗？
- 核心机制
- 治疗耐药伴随基因共表达上下文漂移：单药耐药时祖细胞群落扩张并召回胚胎CP基因，联合AZD1390和放疗耐药时免疫群落扩张；上下文漂移最大的基因是耐药的关键驱动因子和药物靶点。
- 主要证据
- 利用小鼠CPC模型scRNA-seq和RECODR分析发现ATM为治疗脆弱点；AZD1390和放疗耐药后PARP1成为靶点，AZD9574可增强疗效；联合耐药后Dasatinib靶向免疫群落基因，E-D2方案使60%小鼠长期存活。
- 研究意义
- RECODR可揭示现有方法无法检测的耐药机制，为设计合理联合治疗提供新策略，并可能用于临床前和临床中预测治疗耐药及指导联合用药。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证DNA修复基因和ATM作为CPC治疗脆弱点
检验RECODR预测的DNA修复通路和ATM是否对CPC维持和生长重要。
用shRNA敲低227个DNA修复基因，测定CPC克隆形成；用ATM抑制剂AZD1390四种方案治疗CPC小鼠，并与分次放疗比较。
分析单药耐药后的基因上下文漂移并验证候选靶点
识别AZD1390或放疗单药耐药过程中发生上下文漂移的基因，并测试其作为治疗靶点的价值。
对AZD1390耐药（48,068细胞）和放疗耐药（17,544细胞）的CPC进行scRNA-seq和RECODR分析，筛选候选靶点，并用PARP1抑制剂AZD9574在体内验证。
分析联合治疗耐药并验证Dasatinib联合方案
揭示AZD1390联合放疗耐药后的基因上下文变化，并测试Dasatinib能否缓解联合治疗耐药。
对Regimen-E耐药肿瘤进行scRNA-seq（8,032细胞）和RECODR分析，发现免疫群落扩张，筛选Dasatinib；在36只CPC小鼠中测试Dasatinib单药、序贯及联合方案。
在患者样本中应用RECODR预测耐药和候选治疗
检验RECODR能否用于人类癌症治疗耐药的分析和预测。
分析髓母细胞瘤（9例配对样本）和三阴性乳腺癌（47例配对样本）治疗前后的sc/snRNA-seq，计算上下文漂移，聚类并筛选候选药物。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| FACS | BD Aria II流式细胞分选仪 | BD Biosciences | -- |
| 细胞培养 | Neurobasal培养基 | ThermoFisher Scientific | 21103-049 |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | Miltenyi Biotech | 130-093-243 | |
| 人重组表皮生长因子 | Miltenyi Biotech | 130-097-751 | |
| StemPro Accutase细胞消化液 | Gibco | A1110501 | |
| 组织解离 | 木瓜蛋白酶 | Sigma-Aldrich | P4762 |
| DNA酶I | VWR | A3778 | |
| 免疫荧光 | 抗TREM2抗体 | Abcam | ab305103 |
| 抗CD68抗体 | Abcam | ab955 | |
| 抗小鼠/人VLA-4（CD49d）抗体 | BioXCell | BE0071 | |
| Alexa Fluor 647抗小鼠CD45抗体 | Biolegend | 160304 | |
| 小鼠单克隆turboGFP抗体 | Origene | TA150041 | |
| 抗二氢叶酸还原酶（DHFR）抗体 | Abcam | ab152159 | |
| 染色体涂染 | XMP 15小鼠染色体涂染探针 | Metasystems | D-1415-050-OR |
| 空间转录组 | 组织预处理试剂盒 | OGT | LPS100 |
| SPRIselect磁珠 | Beckman Coulter | B23318 | |
| 药物处理 | AZD1390 | AstraZeneca | -- |
| AZD9574 | AstraZeneca | -- | |
| 达沙替尼 | MedChemExpress | HY-10181 | |
| 动物实验 | D-荧光素 | Perkin-Elmer | 122799 |
| 基质胶 | Corning | 354230 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CPC小鼠模型建立与给药 | 细胞接种量5000个CPC细胞/5μL Matrigel，第14代以下细胞；AZD1390 20 mg/kg、Dasatinib 25 mg/kg、AZD9574 3 mg/kg每日口服灌胃；放疗20 Gy，2 Gy/天，5天照射/2天休息 阅读提示：Methods 'In vivo therapeutics'、'Drug treatment'和'Radiation'小节 |
| scRNA-seq样本制备与测序 | FACS分选YFP+/RFP+细胞；10X Chromium Single Cell 3′ v.3建库；NovaSeq 6000测序，目标20,000 reads/细胞；细胞过滤：>200基因、<3000基因、<20%线粒体 阅读提示：Methods 'Single cell RNA-sequencing (scRNAseq)'和'FACS'小节 |
| RECODR图网络构建与上下文漂移评分 | 基因表达过滤≥5%细胞；Pearson相关系数阈值0.1；Node2Vec参数：200次游走、长度80、p=1、q=1；Word2Vec参数：维度64、窗口10、min_counts 5、alpha 0.025、negative 5、10个epoch；评分包括四项指标 阅读提示：Methods 'Resistance through context drift (recodr)'小节 |
| shRNA敲低筛选 | 227个DNA修复基因；shRNA克隆入pFUGWH1-CFP载体；293FT细胞包装病毒；转导CPC、RTBDN-ependymoma或mNSC；克隆形成测定72–120小时 阅读提示：Methods 'shRNA screen'小节 |
| 体内联合治疗试验分组 | Regimen A-G共65只小鼠随机分组；Dasatinib试验36只小鼠分5组（Dasatinib单药、AZD1390后Dasatinib、E-D1、E-D2、E-D3）；具体每组样本量见原文 阅读提示：Figure 4A、Figure 6C及对应图注 |