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        乳腺癌转移过程中肺部免疫重塑的时间进程

        The temporal progression of lung immune remodeling during breast cancer metastasis.

        作者信息Christopher S McGinnis, Zhuang Miao, Daphne Superville, Winnie Yao, Andrei Goga, Nathan E Reticker-Flynn, Juliane Winkler, Ansuman T Satpathy
        PMID38821060
        期刊Cancer Cell
        发布时间2024-06-10
        DOI10.1016/j.ccell.2024.05.004
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        包含PyMT和4T1两种小鼠模型的纵向scRNA-seq、流式验证、qRT-PCR、组织学及公共人类数据再分析，具备功能与机制验证。

        主要模型

        PyMT自发性转移性乳腺癌小鼠模型 4T1原位移植性乳腺癌小鼠模型 人乳腺癌和黑色素瘤脑转移样本scRNA-seq数据 人肺腺癌原发肿瘤和转移淋巴结样本scRNA-seq数据

        重点核对

        PyMT+雌性小鼠在6-14周龄每周取样，9周龄野生型对照，至少2个生物学重复 4T1模型在肿瘤移植后2、4、6、8、10、12、14和21天取样，并设假手术和未手术对照 通过JSD聚类将样本分为早期、中期和晚期转移阶段 流式细胞术检测CD14蛋白丰度和NK细胞亚型比例，每阶段n=5只肺 qRT-PCR检测PyMT mRNA以确认转移负荷，检出限为0.01%肿瘤细胞

        摘要

        肿瘤转移需要远处器官微环境的系统性重塑，影响免疫细胞表型、群体结构和细胞间通讯。然而，我们对转移生态位中免疫表型动态的理解仍然不完整。在本研究中，我们对PyMT和4T1转移性乳腺癌模型从原发肿瘤发生、转移前生态位形成到转移性生长的最终阶段，以单细胞分辨率纵向分析了肺部免疫转录谱。对这些数据的计算分析揭示了一个由外周来源和组织驻留髓系细胞共同执行的TLR-NFκB炎症程序，该程序与转移前生态位形成相关，并反映了原发肿瘤中的CD14+‘活化’髓系细胞。此外，我们观察到小鼠和人类患者样本中原发肿瘤和转移生态位的NK细胞受到差异性调控，转移生态位以细胞毒性NK细胞比例升高为特征。最后，我们鉴定了转移进展过程中IGF1和CCL6信号通路的细胞类型特异性动态调控，这些代表了抗转移免疫治疗的候选靶点。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        乳腺癌转移过程中，肺部免疫细胞在转录组、群体结构和细胞间通讯层面如何随时间动态重塑？
        核心机制
        原发肿瘤来源的信号系统性诱导肺部髓系细胞（包括组织驻留和骨髓来源细胞）表达Cd14并激活TLR-NFκB炎症程序，该程序与转移前生态位形成相关；同时转移生态位中细胞毒性NK细胞比例升高，IGF1和CCL6信号发生细胞类型特异性动态变化。
        主要证据
        PyMT和4T1模型的纵向scRNA-seq显示Cd14+炎症性髓系细胞在转移前生态位富集，流式验证CD14蛋白随转移进展升高；NK细胞分析显示细胞毒性亚型比例增加，并在人转移淋巴结中验证；CellChat预测IGF1-IGF1R和CCL6-CCR1/2信号动态变化。
        研究意义
        提供了转移生态位免疫重塑的纵向图谱，扩展了对TLR-NFκB炎症参与细胞类型的认识，并提出了IGF1和CCL6等抗转移免疫治疗的候选通路。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        建立PyMT纵向scRNA-seq图谱

        纵向刻画PyMT小鼠肺部免疫细胞组成和转录组在转移进展中的动态变化。

        对PyMT+雌性小鼠6-14周龄每周及9周龄野生型对照的肺CD45+免疫细胞进行MULTI-seq标记和scRNA-seq，经质量控制后获得84,545个高质量细胞，来自29个样本。

        2

        计算定义转移阶段并验证转移负荷

        无偏地将样本分组为早期、中期和晚期转移阶段，并确认各阶段的转移负荷。

        使用JSD对样本进行层次聚类分为三个阶段；通过组织学检查和qRT-PCR检测PyMT mRNA评估转移负荷；qRT-PCR滴定实验确定检出限。

        3

        分析髓系细胞亚型和TLR-NFκB炎症程序

        鉴定肺部髓系细胞亚型动态，并验证TLR-NFκB炎症程序与转移前生态位的关联。

        对IM、AM、单核细胞、中性粒细胞和DC进行无监督聚类和差异表达分析；使用NMF鉴定炎症转录签名并进行GSEA；通过流式细胞术检测CD14蛋白丰度；在PyMT验证队列、4T1模型和人类脑转移数据中验证。

        4

        分析淋巴细胞亚型动态

        评估NK、T和B细胞在转移进展中的亚型比例和转录状态变化。

        对NK细胞、T细胞和B细胞进行无监督聚类和比例分析；通过流式细胞术验证NK亚型比例；再分析人肺腺癌淋巴结和肺组织scRNA-seq数据。

        5

        细胞间通讯网络建模

        预测转移各阶段免疫细胞间信号通讯的变化，并鉴定候选通路。

        使用CellChat按转移阶段拆分数据并预测细胞间通讯轴；重点分析CXCL2-CXCR2、TNF-TNFRSF1A/B、IGF1-IGF1R和CCL6-CCR1/2信号。

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        验证样本或模型特征
        组织学实时定量PCR流式细胞术
        验证分子表达变化
        单细胞RNA测序非负矩阵分解基因集富集分析
        验证细胞功能变化
        流式细胞术
        验证机制链路
        CellChat细胞通讯分析
        数据分析与统计
        Jensen-Shannon散度聚类Wilcoxon秩和检验propeller检验

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        肺组织解离分散酶Stemcell Technologies07923
        DNA酶ISigma-Aldrich11284932001
        胶原酶PSigma-Aldrich11249002001
        gentleMACS™ C管Miltenyi Biotec130-093-237
        70 μm MACS SmartStrainer滤网Miltenyi Biotec130-110-916
        细胞冻存Recovery™细胞培养冻存培养基Fisher Scientific12-648-010
        Cryostor Cs10冻存液Biolife Solutions210102
        MULTI-seq标记MULTI-seq脂质修饰寡核苷酸Millipore-SigmaLMO001-100RXN
        流式分析Zombie NIR活性染料BioLegend423105
        Zombie Green活性染料BioLegend423111
        Fc受体阻断剂Tonbo700161U500
        FITC抗小鼠Ter119抗体Fisher Scientific11-5921-82
        FITC抗小鼠CD31抗体Fisher Scientific11-0311-82
        violetFluor450抗小鼠CD45抗体Tonbo75-0451-U100
        FITC抗小鼠CD3抗体Fisher Scientific11-0032-82
        APC抗小鼠Ly6g抗体Tonbo20-1276-U025
        PerCP-Cy5.5抗小鼠CD11b抗体Fisher Scientific45-0112-80
        FITC抗小鼠CD19抗体Fisher Scientific11-0193-81
        PE抗小鼠THY1.1抗体Fisher Scientific12-0900-81
        APC抗小鼠CD27抗体BioLegend124211
        eFluor 506抗小鼠KLRG1抗体Fisher Scientific69-5893-82
        PE-Cy7抗小鼠NKp46抗体Fisher Scientific25-3351-80
        APC-Cy7抗小鼠CD45抗体Fisher ScientificA15395
        eFluor 450抗小鼠CD49b抗体Fisher Scientific48-5971-80
        PE-Cy7抗小鼠SIGLEC-F抗体Fisher Scientific25-1702-82
        BV421抗小鼠MHC-II抗体Fisher Scientific404-5321-80
        BV605抗小鼠CD64抗体BioLegend139323
        PE抗小鼠CD14抗体Fisher Scientific12-0141-81
        FITC抗小鼠谱系抗体混合物BioLegend133306
        PE抗小鼠CD24抗体BioLegend138504
        PE-Cy7抗小鼠CD133抗体BioLegend141209
        scRNA-seq文库构建Chromium单细胞3’试剂盒v3.110x Genomics1000121, 1000120, 1000213
        qRT-PCRHigh-Capacity cDNA逆转录试剂盒Applied Biosystems4368814
        Direct-zol RNA小量提取试剂盒Zymo ResearchR2053
        SsoAdvanced™通用SYBR® Green预混液BioRad1725271
        肿瘤解离Miltenyi肿瘤解离试剂盒Miltenyi Biotec130-096-730
        文库质控Agilent高灵敏度DNA试剂盒Agilent5067-4626
        Qubit dsDNA HS检测试剂盒Fisher ScientificQ32854
        文库纯化SPRIselect磁珠Beckman CoulterB23319
        4T1肿瘤移植生长因子减少型MatrigelCorning354230
        红细胞裂解ACK裂解缓冲液Fisher ScientificA1049201

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        PyMT纵向scRNA-seq
        小鼠周龄（6-14周）、生物学重复数（至少2）、每个样本细胞数（平均2,915）
        阅读提示：Methods 'Lung dissociation and cryopreservation'与'scRNA-seq sample preparation'；Figure 1A和Figure S1A
        4T1纵向scRNA-seq
        肿瘤细胞注射量（5×10^5）、注射体积（50 μL）、Matrix胶浓度（50%）、取样时间点（2-21天）
        阅读提示：Methods '4T1 orthotopic tumor transplantation'；Figure S5
        转移阶段定义与验证
        JSD聚类分组、组织学转移灶计数、qRT-PCR检出限（0.01%）
        阅读提示：Results 'Longitudinal scRNA-seq analysis...'；Figure S1B-S1E
        流式细胞术检测CD14和NK亚型
        每阶段肺样本数（n=5）、抗体克隆号和稀释比例、CD14几何平均荧光强度统计方法
        阅读提示：Methods 'Flow cytometry'；Figure 5E和Figure 6B
        CellChat细胞通讯分析
        按转移阶段拆分数据、CellChat版本（1.6.1）、信号通路（CXCL2-CXCR2、TNF-TNFRSF1A/B、IGF1-IGF1R、CCL6-CCR1/2）
        阅读提示：Methods 'Intercellular signaling predictions'；Figure 7和Figure S7

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