构建Msi2-CreERT2敲入小鼠并验证表达保真性
验证Msi2-CreERT2模型能否忠实标记MSI2+细胞。
将CreERT2整合到Msi2基因ATG位点，与R26R-LSL-tdTomato报告小鼠杂交，他莫昔芬处理后检测tdTomato与MSI2表达的一致性。
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单细胞图谱鉴定MSI+细胞是胰腺癌多种亚型的共同起源
Single-cell mapping identifies MSI+ cells as a common origin for diverse subtypes of pancreatic cancer.
实验完整度
高包含体外类器官、小鼠自体模型、异种移植、患者样本及单细胞多组学，并有功能敲低验证
主要模型
Msi2-CreERT2; CAG-LSL-MycT58A小鼠 Msi2-Myc; Kras小鼠 NSG小鼠移植模型 患者来源异种移植(PDX)
重点核对
Msi2-Myc小鼠中他莫昔芬诱导MYC后5周(t=5)和10-12周(t=12)的单细胞RNA-seq 单细胞ATAC-seq检测t=5和t=12时腺泡和导管谱系位点可及性 shRNA敲低HMMR对小鼠和人ASCP细胞体外类器官形成及体内移植瘤生长的影响 患者来源PDX中shHMMR对肿瘤细胞频率的影响 人胰腺癌组织芯片中HMMR和MYC的免疫染色
摘要
鉴定癌症起源细胞对于理解肿瘤演化的分子基础至关重要。为了确定干/祖细胞能否作为起源细胞，我们构建了Msi2-CreERT2敲入小鼠。当与CAG-LSL-MycT58A小鼠杂交时，Msi2-CreERT2小鼠发生了多种胰腺癌亚型：导管型、腺泡型、腺鳞癌和罕见的间变性肿瘤。结合单细胞基因组学与发育状态及谱系轨迹的计算分析，我们证明MYC优先触发最不成熟的MSI2+胰腺细胞转化为多谱系癌前细胞。这些癌前细胞随后通过激活不同的转录程序和大规模基因组改变而分化为不同的胰腺癌亚型，强制表达特定信号如Ras可以重定向亚型特化。本研究显示多种胰腺癌亚型可起源于共同的MSI2+细胞池，并提供了一个强大的模型来理解和控制塑造胰腺癌不同命运的程序。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 确定干/祖细胞能否作为胰腺癌多种亚型的起源细胞，以及不同亚型如何从共同起源分化而来。
- 核心机制
- MYC优先转化最不成熟的MSI2+胰腺细胞为多谱系癌前细胞，这些癌前细胞通过激活不同转录程序和大规模基因组改变分化为不同亚型，Ras信号可重定向亚型特化。
- 主要证据
- Msi2-Myc小鼠发生PDAC、ASCP、ACC和间变性肿瘤；单细胞RNA-seq和ATAC-seq显示癌前细胞具有多谱系潜能；Ras激活驱动导管/鳞状命运；HMMR敲低抑制ASCP生长。
- 研究意义
- 证明多种胰腺癌亚型可起源于共同MSI2+细胞池，提供强大模型理解胰腺癌不同命运的程序，并鉴定HMMR为ASCP潜在依赖。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
诱导MYC表达并鉴定多组织肿瘤发生
确定MSI2+细胞能否作为多种癌症的起源细胞。
将Msi2-CreERT2小鼠与CAG-LSL-MycT58A小鼠杂交，他莫昔芬诱导后观察各组织肿瘤发生情况。
鉴定胰腺肿瘤亚型及频率
明确Msi2-Myc小鼠胰腺肿瘤的亚型组成。
使用组织学和谱系标志物(CK19、AMY、CK5/14、p63等)对胰腺肿瘤进行分类。
单细胞转录组追踪癌前状态和亚型分化轨迹
确定MYC转化靶细胞及亚型分化的分子轨迹。
对他莫昔芬后0周、5周和10-12周的胰腺细胞进行scRNA-seq，结合CytoTRACE、Monocle、InferCNV分析。
单细胞ATAC-seq检测表观遗传状态
确定癌前细胞和亚型特化过程中的染色质可及性变化。
对t=5和t=12的EpCAM+细胞进行scATAC-seq，分析腺泡和导管谱系位点可及性。
原位移植癌前细胞验证多谱系肿瘤形成能力
实验验证共同癌前细胞池能否产生多种胰腺癌亚型。
从Msi2-Myc; R26-LSL-tdTomato小鼠t=5分离癌前细胞，原位移植到NSG小鼠胰腺，对终末期肿瘤进行scRNA-seq。
Ras信号重定向亚型特化的功能验证
验证Ras信号是否足以将肿瘤命运转向导管/鳞状谱系。
将Msi2-Myc小鼠与KrasLSL-G12D/+小鼠杂交，观察肿瘤亚型变化。
鉴定ASCP依赖基因
寻找ASCP的潜在功能依赖。
对ASCP富集基因进行shRNA敲低，检测对类器官形成和体内肿瘤生长的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 他莫昔芬诱导 | 他莫昔芬 | Millipore-Sigma | T5648 |
| 组织解离 | 胶原酶P | Roche | 11249002001 |
| DNase I | Roche | 47167280001 | |
| 链霉蛋白酶 | Roche | -- | |
| 细胞培养 | 小鼠胰腺类器官培养基 | Stem Cell Technologies | 06040 |
| 人胰腺类器官培养基 | Stem Cell Technologies | 100-0781 | |
| 类器官培养 | 基质胶(生长因子减少型) | Corning | 354230 |
| 流式分析 | 抗小鼠EpCAM-PE/Cy7抗体 | Thermo Fisher/Invitrogen | 50-112-9753 |
| 抗小鼠CD45-PE/Cy7抗体 | Thermo Fisher/Invitrogen | 25-0451-82 | |
| 抗小鼠CD31-PE抗体 | Thermo Fisher/Invitrogen | 12-0311-82 | |
| 抗人EpCAM-PE抗体 | eBioscience (ThermoFisher) | 12-9326-42 | |
| 免疫荧光 | GFP抗体 | Abcam | ab13970 |
| 淀粉酶抗体 | Abcam | ab21156 | |
| CK19抗体 | Millipore | MABT293 | |
| Msi2抗体 | Abcam | ab76148 | |
| c-MYC抗体 | Abcam | ab32072 | |
| p63(deltaN)抗体 | Biolegend | 619002 | |
| CK5抗体 | Biolegend | 905501 | |
| CK14抗体 | Invitrogen | MA5-11599 | |
| HMMR抗体 | LS Bio | LS-B7037 | |
| RNA提取 | RNeasy Micro Plus试剂盒 | Qiagen | 74034 |
| RNeasy Plus Mini试剂盒 | Qiagen | 74134 | |
| RT-qPCR | iQ SYBR Green预混液 | BioRad | 1708882 |
| qScript cDNA预混液 | Quantabio | 101414-102 | |
| RNA-seq文库构建 | Illumina TruSeq链特异性mRNA样本试剂盒 | Illumina | 20020594 |
| scRNA-seq | Chromium单细胞3' GEM文库与凝胶珠试剂盒v3 | 10x Genomics | PN-1000269 |
| scATAC-seq | Chromium单细胞ATAC文库与凝胶珠试剂盒 | 10x Genomics | 1000176 |
| DNA提取 | AllPrep DNA/RNA FFPE试剂盒 | Qiagen | 80234 |
| 质粒提取 | Zippy质粒小量提取试剂盒 | Zymo Research | 11-309 |
| 慢病毒包装 | XtremeGENE HP DNA转染试剂 | Millipore-Sigma | 6366546001 |
| 慢病毒浓缩 | Lenti-X浓缩试剂 | Takara Bio | 631231 |
| 慢病毒感染 | Polybrene感染/转染试剂 | Millipore-Sigma | TR-1003-G |
| 细胞培养 | Foundation B胎牛血清 | Gemini Bio | 900-208-500 |
| 重组人EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| 人FGF-basic重组蛋白 | ThermoFisher | 13256-029 | |
| 流式分析 | SYTOX Blue死细胞染料 | ThermoFisher | S34857 |
| 慢病毒载体 | pLV[shRNA]-EGFP-U6>[huHMMR]载体 | VectorBuilder | VB221013-1385ygq |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体内他莫昔芬诱导 | 他莫昔芬剂量(2 mg/20 g体重)、给药次数(3次/5天)、小鼠年龄(6-8周) 阅读提示：Methods: In vivo tamoxifen delivery |
| 胰腺组织解离 | 胶原酶P浓度(0.6 mg/ml)、消化时间(15分钟+20分钟)、EGTA/钙缓冲液使用 阅读提示：Methods: Tissue dissociation, cell isolation, and FACS analysis |
| 原位移植癌前细胞 | 细胞数量(5万-10万)、受体小鼠品系(NSG或NOD/SCID)和周龄(6-8周)、Matrigel比例(1:1) 阅读提示：Methods: Orthotopic transplantation of flow-sorted mouse precancer cells |
| 类器官形成实验 | 细胞数量(300-500)、Matrigel体积(10 μL或50 μL)、培养基类型和换液时间、计数时间(7-10天或12-14天) 阅读提示：Methods: In vitro matrigel colony formation assay |
| shRNA敲低HMMR | shRNA序列(Table S2)、病毒感染MOI、敲低效率验证方法 阅读提示：Methods: Cloning of shRNA constructs and lentivirus production; Table S2 |
| PDX体内敲低实验 | PDX来源、细胞数量(25万)、感染MOI(25)、Polybrene浓度(8 μg/mL)、移植部位(右侧腹) 阅读提示：Methods: Patient-derived xenograft (PDX) transplantation and dependency analysis in vivo |