调控RNA剪接增强白血病对BCL2抑制的应答

Modulation of RNA splicing enhances response to BCL2 inhibition in leukemia.

作者信息Eric Wang, Jose Mario Bello Pineda, Won Jun Kim, Sisi Chen, Jessie Bourcier, Maximilian Stahl, Simon J Hogg, Jan Phillipp Bewersdorf, Cuijuan Han, Michael E Singer, Daniel Cui, Caroline E Erickson, Steven M Tittley, Alexander V Penson, Katherine Knorr, Robert F Stanley, Jahan Rahman, Gnana Krishnamoorthy, James A Fagin, Emily Creger, Elizabeth McMillan, Chi-Ching Mak, Matthew Jarvis, Carine Bossard, Darrin M Beaupre, Robert K Bradley, Omar Abdel-Wahab

PMID36563682

期刊Cancer Cell

发布时间2023-01-09

DOI10.1016/j.ccell.2022.12.002

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实验完整度

高

含全基因组及RBP聚焦CRISPR筛选、多种AML细胞系、Rbm10条件敲除小鼠、NSG移植瘤及PDX模型，并有功能与机制验证

主要模型

人AML细胞系MOLM-13（MLL-AF9易位伴FLT3ITD）多种人AML细胞系（THP-1、U937、KG-1等） NSG/NSGS小鼠移植瘤及PDX模型 Rbm10条件敲除（Mx1-cre Rbm10fl/y）小鼠

重点核对

CRISPR筛选及验证中venetoclax处理浓度为25 nM（筛选）或50 nM（竞争实验）体内venetoclax给药剂量100 mg/kg/天，口服灌胃，vehicle对照 SM09419体内给药25 mg/kg每日口服，PDX模型给药3周 RBM10敲除验证采用Western blot及NGS indel分析 Synergy以ZIP、Loewe、HSA模型计算，至少3个技术/生物学重复

摘要

治疗耐药是癌症治疗中的主要挑战。本文中，我们在急性髓系白血病（AML）广泛使用的多种疗法中进行了CRISPR-Cas9筛选，以鉴定药物应答的基因组决定因素。我们的筛选揭示了对RNA剪接因子的选择性依赖，其缺失优先增强对BCL2抑制剂venetoclax的应答。剪接因子RBM10缺失在白血病中增强对venetoclax的应答，但对正常造血完全非必需。联合抑制RBM10和BCL2导致凋亡抑制因子XIAP的错误剪接和失活，并下调BCL2A1——一种与venetoclax耐药相关的抗凋亡蛋白。抑制剪接激酶家族CLKs和DYRKs导致关键剪接因子和凋亡因子的异常剪接，与venetoclax协同并克服对BCL2抑制的耐药。我们的发现强调了剪接在调节治疗应答中的重要性，并提供了改善venetoclax为基础治疗的策略。

全基因组CRISPR筛选鉴定药物应答基因

鉴定介导致敏或耐药的基因组决定因素

将Brunello sgRNA文库转导MOLM-13 Cas9细胞，第8天用多种AML药物治疗，第20天评估sgRNA丰度变化

RBP聚焦CRISPR筛选及候选验证

验证RNA剪接因子对venetoclax应答的影响

使用靶向492个RNA结合蛋白功能域的2,855条sgRNA文库进行筛选，并对RBM10等候选基因进行竞争实验验证

RBM10缺失在体外增强venetoclax疗效

评估RBM10缺失对AML细胞对venetoclax敏感性的影响

在多种分子亚型AML细胞系中进行剂量反应曲线和竞争增殖实验，包括TP53突变细胞系

RBM10缺失体内增强venetoclax疗效

评估RBM10缺失对体内白血病负荷和生存的影响

将表达荧光素酶的MOLM-13细胞移植入NSG小鼠，发病后给予venetoclax或vehicle

Rbm10条件敲除小鼠造血功能评估

评估Rbm10缺失对正常造血的影响

构建Rbm10 cKO小鼠，pIpC诱导后行集落形成实验和竞争性骨髓移植

RBM10结合与剪接机制分析

阐明RBM10调控剪接及XIAP、BCL2A1的机制

进行RBM10 eCLIP和RNA-seq，分析差异剪接事件，并用cDNA回补和XIAP/BCL2A1过表达验证

SM09419与venetoclax协同及耐药克服

评估CLK/DYRK抑制剂与venetoclax联合的协同作用及对耐药的克服

在AML细胞系、venetoclax耐药MOLM-13及PDX模型中进行药物联用和单药实验

实验环节	名称	品牌	货号
Western blot	抗RBM10兔多克隆抗体	Bethyl Laboratories	A301-006A
β-肌动蛋白HRP抗体	Sigma Aldrich	A3854
抗磷酸化SR蛋白抗体克隆1H4	Millipore Sigma	MABE50
抗总SR蛋白抗体(1H4)	Santa Cruz	sc-13509
抗XIAP抗体	Cell Signaling	2042S
抗U2AF2抗体	Abcam	ab37530
抗RBM5抗体	Abcam	ab245646
抗MCL-1抗体	SantaCruz	sc-12756
抗FLT3抗体	Cell Signaling	3462S
流式分析	Fc受体封闭试剂	BioLegends	422302
FITC抗人CD45抗体	BioLegend	368507
APC抗小鼠CD45抗体	BioLegend	103111
PE抗人CD34抗体	BioLegend	343605
APC/Cyanine7抗人CD38抗体	BioLegend	303533
药物处理	维奈克拉	Fisher	NC1235948
SM09419	BioSplice	--
阿糖胞苷	Sigma	BP383
依托泊苷	Sigma	E1383-25MG
盐酸伊达比星	Sigma	I1656-10MG
米哚妥林	SelleckChem	S8064
5-氮杂胞苷	SelleckChem	S1782
细胞培养	G418	ThermoFisher Scientific	10131027
杀稻瘟菌素	Fisher	A1113903
聚凝胺	Sigma Aldrich	TR-1003-G
聚乙烯亚胺	Polysciences, Inc	23966
RNA提取	RNeasy Plus微型试剂盒	Qiagen	74136
集落形成实验	MethoCult GF M3434培养基	StemCell Technologies	03434
细胞活力检测	CellTiter-Glo发光细胞活力检测	Promega	G7572
gDNA提取	NucleoSpin血液XL提取试剂盒	Takara	740950.1
cDNA合成	Verso cDNA合成试剂盒	ThermoFisher Scientific	AB1453B
NanoBRET	Nano-Glo双荧光素酶报告基因检测	Promega	N1610
激酶实验	Z’-LYTE激酶实验	ThermoFisher Scientific	PV3190
PCR	Phusion Flash高保真PCR预混液	Fisher	F548L
文库构建	KAPA Hyper文库构建试剂盒	Roche	KK8500
体内成像	D-荧光素钾盐	Gold-Bio Technology	LUCK-500

实验环节

名称

品牌

货号

Western blot

抗RBM10兔多克隆抗体

Bethyl Laboratories

A301-006A

β-肌动蛋白HRP抗体

Sigma Aldrich

A3854

抗磷酸化SR蛋白抗体克隆1H4

Millipore Sigma

MABE50

抗总SR蛋白抗体(1H4)

Santa Cruz

sc-13509

抗XIAP抗体

Cell Signaling

2042S

抗U2AF2抗体

Abcam

ab37530

抗RBM5抗体

Abcam

ab245646

抗MCL-1抗体

SantaCruz

sc-12756

抗FLT3抗体

Cell Signaling

3462S

流式分析

Fc受体封闭试剂

BioLegends

422302

FITC抗人CD45抗体

BioLegend

368507

APC抗小鼠CD45抗体

BioLegend

103111

PE抗人CD34抗体

BioLegend

343605

APC/Cyanine7抗人CD38抗体

BioLegend

303533

药物处理

维奈克拉

Fisher

NC1235948

SM09419

BioSplice

阿糖胞苷

Sigma

BP383

依托泊苷

Sigma

E1383-25MG

盐酸伊达比星

Sigma

I1656-10MG

米哚妥林

SelleckChem

S8064

5-氮杂胞苷

SelleckChem

S1782

细胞培养

G418

ThermoFisher Scientific

10131027

杀稻瘟菌素

Fisher

A1113903

聚凝胺

Sigma Aldrich

TR-1003-G

聚乙烯亚胺

Polysciences, Inc

23966

RNA提取

RNeasy Plus微型试剂盒

Qiagen

74136

集落形成实验

MethoCult GF M3434培养基

StemCell Technologies

03434

细胞活力检测

CellTiter-Glo发光细胞活力检测

Promega

G7572

gDNA提取

NucleoSpin血液XL提取试剂盒

Takara

740950.1

cDNA合成

Verso cDNA合成试剂盒

ThermoFisher Scientific

AB1453B

NanoBRET

Nano-Glo双荧光素酶报告基因检测

Promega

N1610

激酶实验

Z’-LYTE激酶实验

ThermoFisher Scientific

PV3190

PCR

Phusion Flash高保真PCR预混液

Fisher

F548L

文库构建

KAPA Hyper文库构建试剂盒

Roche

KK8500

体内成像

D-荧光素钾盐

Gold-Bio Technology

LUCK-500

环节	核对要点
全基因组CRISPR筛选	药物浓度（venetoclax 25 nM、cytarabine 50 nM等）、处理时间（转导后第8天）、测序时间点（第20天）、感染复数（约0.3）阅读提示：STAR Methods中CRISPR Screen小节及Figure 1A图注
RBM10体内实验	细胞接种量（100,000）、照射剂量（5.5 Gy）、venetoclax剂量（100 mg/kg/天）及给药途径（口服灌胃）、每组小鼠数阅读提示：STAR Methods中Animal experiments小节及Figure 2图注
Rbm10条件敲除与造血评估	pIpC诱导方案、集落形成接种密度（20,000细胞/重复）、培养天数（7天）、移植细胞量（0.5百万）及照射剂量（2×450 cGy）阅读提示：STAR Methods中Colony-forming assays与Bone marrow transplantation小节及Figure 2图注
SM09419体内及PDX实验	SM09419剂量（25 mg/kg每日口服）、给药时长（3周）、PDX接种细胞量（4百万，股骨内注射）、vehicle组成（5% polyvinylpyrrolidone）阅读提示：STAR Methods中Patient-derived xenograft experiments小节及Figure 6C图注
RNA-seq与eCLIP	处理浓度与时间（SM09419 100 nM、venetoclax 10 nM、48小时）、每组重复数（n=3）、eCLIP重复数（4个）阅读提示：Figure 5A图注及STAR Methods中eCLIP与RNA-seq小节

环节

核对要点

全基因组CRISPR筛选

药物浓度（venetoclax 25 nM、cytarabine 50 nM等）、处理时间（转导后第8天）、测序时间点（第20天）、感染复数（约0.3）

阅读提示：STAR Methods中CRISPR Screen小节及Figure 1A图注

RBM10体内实验

细胞接种量（100,000）、照射剂量（5.5 Gy）、venetoclax剂量（100 mg/kg/天）及给药途径（口服灌胃）、每组小鼠数

阅读提示：STAR Methods中Animal experiments小节及Figure 2图注

Rbm10条件敲除与造血评估

pIpC诱导方案、集落形成接种密度（20,000细胞/重复）、培养天数（7天）、移植细胞量（0.5百万）及照射剂量（2×450 cGy）

阅读提示：STAR Methods中Colony-forming assays与Bone marrow transplantation小节及Figure 2图注

SM09419体内及PDX实验

SM09419剂量（25 mg/kg每日口服）、给药时长（3周）、PDX接种细胞量（4百万，股骨内注射）、vehicle组成（5% polyvinylpyrrolidone）

阅读提示：STAR Methods中Patient-derived xenograft experiments小节及Figure 6C图注

RNA-seq与eCLIP

处理浓度与时间（SM09419 100 nM、venetoclax 10 nM、48小时）、每组重复数（n=3）、eCLIP重复数（4个）

阅读提示：Figure 5A图注及STAR Methods中eCLIP与RNA-seq小节

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