CRISPR筛选鉴定YTHDC1为必需m6A阅读蛋白
探索m6A在髓系白血病中发挥作用的关键阅读蛋白。
分析14个AML细胞系全基因组CRISPR筛选数据中已知m6A阅读蛋白的必需性排名。
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mRNA上的N6-甲基腺苷促进相分离核体形成并抑制髓系白血病分化
N6-Methyladenosine on mRNA facilitates a phase-separated nuclear body that suppresses myeloid leukemic differentiation.
实验完整度
高包含CRISPR筛选、多种AML细胞系、患者样本、PDX小鼠模型、体外相分离及机制验证
主要模型
MOLM13、OCIAML3等AML细胞系 人脐血CD34+造血干/祖细胞 原代AML患者细胞及PDX小鼠模型 NSG小鼠移植瘤模型
重点核对
shRNA/CRISPR敲低YTHDC1后检测MOLM13、OCIAML3等AML细胞增殖、分化和凋亡 YTHDC1结构域突变体（W377A/W428A、ΔpolyE、ΔR+P）在293T和OCIAML3细胞中的相分离和功能回补 体外纯化YTHDC1蛋白与m6A RNA的液滴形成及FRAP实验 NSG小鼠尾静脉移植YTHDC1敲低MOLM13或PDX细胞后的生存曲线
摘要
mRNA上的N6-甲基腺苷（m6A）介导不同的生物学过程，其失调促进肿瘤发生。m6A如何在白血病中决定其多样的分子和细胞效应仍不清楚。我们从全基因组CRISPR筛选发现YTHDC1是髓系白血病中必需的m6A阅读蛋白，且m6A是YTHDC1发生液-液相分离并形成核YTHDC1-m6A凝聚体（nYACs）所必需的。与正常造血干/祖细胞相比，急性髓系白血病（AML）细胞中nYACs数量增加。AML细胞需要nYACs来维持细胞存活和未分化状态，这对白血病维持至关重要。此外，nYACs使YTHDC1能够保护m6A-mRNA免受PAXT复合物和外体相关RNA降解的影响。总之，m6A是形成由相分离介导的核体所必需的，该核体维持mRNA稳定性并控制癌细胞存活和分化。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- m6A如何在髓系白血病中决定其多样的分子和细胞效应，以及YTHDC1在其中的作用机制。
- 核心机制
- m6A是YTHDC1发生液-液相分离并形成核YTHDC1-m6A凝聚体（nYACs）所必需的；nYACs保护m6A-mRNA免受PAXT复合物和外体介导的降解，从而维持mRNA稳定性。
- 主要证据
- 全基因组CRISPR筛选确定YTHDC1为必需阅读蛋白；AML细胞系和患者样本中YTHDC1高表达；YTHDC1敲低降低细胞增殖、增加分化和凋亡；体外和细胞内相分离实验；PDX和小鼠移植实验；RNA-seq、iCLIP、Hyper-TRIBE和RIP等。
- 研究意义
- 研究提出nYACs相分离为核内控制m6A-mRNA命运提供了调控机制，并将此与维持细胞生长和分化状态的功能需求联系起来；YTHDC1可能成为髓系白血病的治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证YTHDC1在AML中的表达
比较YTHDC1在AML细胞和正常造血细胞中的表达水平。
免疫印迹检测AML细胞系和原代AML患者细胞中YTHDC1蛋白丰度，并与正常CD34+ HSPC比较。
敲低YTHDC1检测AML细胞表型
确定YTHDC1对AML细胞存活、增殖和分化的影响。
用shRNA或CRISPR-Cas9敲低/敲除YTHDC1，检测细胞增殖、凋亡和髓系分化标志物。
体内验证YTHDC1对白血病发生的作用
评估YTHDC1是否在体内白血病发生中必需。
将YTHDC1敲低的MOLM13细胞或PDX细胞移植到NSG小鼠，监测生存和植入。
检测YTHDC1凝聚体在AML和正常细胞中的差异
比较AML细胞和正常HSPC中YTHDC1核凝聚体的数量和特征。
免疫荧光和活细胞成像观察YTHDC1 puncta，定量凝聚体数量和荧光强度。
体外和细胞内验证YTHDC1液-液相分离
确定YTHDC1是否通过液-液相分离形成凝聚体，以及m6A的作用。
纯化重组EGFP-YTHDC1蛋白，与m6A或非m6A RNA混合观察液滴形成，并进行FRAP和融合实验；在细胞内表达EGFP-YTHDC1及突变体进行活细胞成像和FRAP。
鉴定YTHDC1结构域和m6A结合对nYACs及功能的影响
确定YTHDC1的IDR和YTH结构域在相分离及白血病细胞功能中的作用。
构建YTHDC1突变体（W377A/W428A、ΔpolyE、ΔR+P），在293T和OCIAML3细胞中检测凝聚体形成，并进行回补实验检测增殖和分化。
验证YTHDC1对正常HSPC的影响
比较YTHDC1在正常造血干/祖细胞和白血病细胞中的依赖性差异。
在CB-CD34+细胞中敲低或过表达YTHDC1及突变体，检测增殖、集落形成和分化。
解析YTHDC1调控的mRNA靶标及机制
确定YTHDC1如何影响m6A-mRNA的丰度和稳定性。
RNA-seq、iCLIP、Hyper-TRIBE、miCLIP数据整合，qPCR验证靶标，mRNA稳定性实验，RNA-FISH与RRP6/PABPN1/MTR4共定位，RIP和dot blot。
验证MYC为YTHDC1功能性直接靶标
确定MYC在YTHDC1介导的AML细胞功能中的作用。
检测MYC mRNA和蛋白水平，荧光素酶报告基因实验，MYC过表达回补实验。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI1640培养基 | -- | -- |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| L-谷氨酰胺-青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| CD34+细胞分离 | Auto MACS Pro分离器和分离试剂盒 | Miltenyi | -- |
| CD34+细胞培养 | IMDM培养基 | Cellgro | -- |
| BIT 9500培养基 | Stem Cell Technologies | -- | |
| 干细胞因子 | Peprotech | 300-07 | |
| FLT-3配体 | Peprotech | 300-19 | |
| 白细胞介素-6 | Peprotech | 200-06 | |
| 血小板生成素 | Peprotech | 300-18 | |
| 白细胞介素-3 | Peprotech | 200-03 | |
| 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | Peprotech | 300-03 | |
| 粒细胞集落刺激因子 | Peprotech | 300-23 | |
| 红系分化 | 促红细胞生成素 | -- | -- |
| 原代AML细胞培养 | 聚凝胺 | Millipore | TR-1003-G |
| 小鼠移植 | 嘌呤霉素 | Thermo Fisher Scientific | A11138-031 |
| 流式细胞术 | APC标记抗人CD11b抗体 | ThermoFisher | CD11b 05 |
| APC标记抗人CD13抗体 | ThermoFisher | MHCD1305 | |
| PE标记抗人CD14抗体 | BD Pharmingen | 555398 | |
| PE标记抗人CD33抗体 | BD Pharmingen | 555450 | |
| PE标记膜联蛋白V | BD Pharmingen | 556421 | |
| PB标记抗小鼠CD45.1抗体 | Invitrogen | 110722 | |
| PerCP-Cyanine 5.5标记抗人CD45抗体 | eBioscience | 45-9459-42 | |
| 免疫印迹 | YTHDC1抗体 | Abcam | Ab122340 |
| RRP6抗体 | Abcam | Ab50558 | |
| PABPN1抗体 | Abcam | Ab75855 | |
| MTR4抗体 | Abcam | Ab70551 | |
| GFP抗体 | Cell signaling Technology | 2956 | |
| METTL3抗体 | Proteintech | 150731-1-AP | |
| METTL14抗体 | Sigma | HPA038002 | |
| MYC抗体 | Cell signaling Technology | 5605S | |
| 肌动蛋白抗体 | Sigma Aldrich | A3854 | |
| m6A dot blot | m6A抗体 | Synaptic Systems | 202003 |
| 免疫荧光 | BRD4抗体 | Atlas Antibodies | AMAb90841 |
| NPM1抗体 | Thermo Fisher Scientific | MA512508 | |
| SRSF2抗体 | Abcam | Ab11826 | |
| Coilin抗体 | Abcam | Ab87913 | |
| PML抗体 | Abcam | Ab96051 | |
| 细胞培养 | 4-羟基他莫昔芬 | Sigma Aldrich | H7904 |
| 集落形成实验 | MethoCult H4434甲基纤维素培养基 | Stem Cell Technologies | 04434 |
| RNA提取 | TRIZOL试剂 | Life Technologies | -- |
| 逆转录 | Verso cDNA合成试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | AB1453-B |
| qPCR | Power SYBR Green PCR预混液 | Thermo Fisher Scientific | 4367659 |
| 新生RNA捕获 | Click-iT新生RNA捕获试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | C10365 |
| 荧光素酶报告基因实验 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | E1910 |
| RNA免疫沉淀 | Magna RIP RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒 | Millipore | 17-700 |
| RNA-FISH | RNAscope多重荧光检测试剂盒 | Advanced Cell Diagnostics | 320851 |
| 体外相分离 | 葡聚糖T500 | Pharmacosmos | -- |
| 384孔玻璃底板 | Greiner bio-one | -- | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | -- | |
| 蛋白纯化 | 肝素柱 | GE healthcare | -- |
| 镍离子亲和层析 | -- | -- | |
| 体外转录 | m6ATP | TriLink | -- |
| NucleoSpin RNA纯化试剂盒 | MACHEREY-NAGEL | -- | |
| RNA提取 | RNeasy Plus Micro试剂盒 | QIAGEN | 74034 |
| CD34+细胞分离 | CD34微珠试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-046-702 |
| 小鼠品系 | NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ小鼠 | The Jackson Laboratory | 005557 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| AML细胞系中YTHDC1敲低 | shRNA序列（sh1: TGGATTTGCAGGCGTGAATT；sh2: TGCCTCCAGAGAACCTTATA）和嘌呤霉素筛选浓度（3 μg/ml） 阅读提示：Methods“Plasmid constructs and transfection”和“Proliferation assay”小节 |
| 小鼠移植实验 | NSG小鼠周龄（6–8周）、性别（雌性）、照射剂量（200 cGy）、细胞接种量（500,000 MOLM13细胞）和注射途径（尾静脉） 阅读提示：Methods“In vivo transplantation of human leukemia cells”小节 |
| 体外相分离实验 | YTHDC1蛋白浓度（2 μM）、RNA浓度（40 nM）、RNA长度（65-nt）和m6A修饰数量（10个），以及缓冲液组成 阅读提示：Methods“In vitro phase separation assay”小节和图3F |
| CD34+ HSPC培养和分化 | 细胞因子组合和浓度（SCF 100 ng/ml、FLT-3 ligand 10 ng/ml、IL-6 20 ng/ml、TPO 100 ng/ml等） 阅读提示：Methods“Purification and culture of cord blood (CB) derived HSPC-CD34+ cells”小节 |
| mRNA稳定性实验 | 放线菌素D浓度（5 μg/ml）和处理时间点 阅读提示：Methods“mRNA stability assay”小节 |