临床样本与细胞系中YTHDF3表达分析
验证YTHDF3表达与乳腺癌脑转移的相关性
分析GEO公共数据集、TCGA数据、患者组织IHC、脑转移细胞系Western blot
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
YTHDF3通过促进m6A富集转录本的翻译推动乳腺癌脑转移
YTHDF3 Induces the Translation of m6A-Enriched Gene Transcripts to Promote Breast Cancer Brain Metastasis.
实验完整度
高包含体外细胞系、动物脑转移模型、患者组织样本及组学分析，并进行功能与机制验证。
主要模型
人乳腺癌细胞系MDA-MB-231及其脑转移衍生株MDA-MB-231Br 小鼠乳腺癌细胞系4T1及其脑转移衍生株4T1Br 人乳腺癌细胞系MDA-IBC3 小鼠脑转移模型（心内注射）
重点核对
心内注射细胞数量：MDA-MB-231亲本及Br细胞2.5×10^5/只，4T1亲本及Br细胞5×10^4/只，MDA-IBC3 5×10^5/只 YTHDF3敲低使用两个独立shRNA（shRNA1和shRNA2） 脑转移计数在H&E染色左侧大脑半球连续矢状切片中评估，微转移≤300 μm，大转移≥300 μm BLI使用D-luciferin 150 mg/kg腹腔注射，IVIS Spectrum检测 RNA稳定性实验使用放线菌素D 5 mg/ml处理
摘要
脑转移是癌症死亡的主要原因，但其分子机制研究严重不足。此外，关于m6A阅读蛋白YTHDF3在人类疾病中的作用所知甚少。本文显示，YTHDF3过表达在临床上与乳腺癌患者的脑转移相关。YTHDF3促进癌细胞与脑内皮细胞和星形胶质细胞的相互作用、血脑屏障外渗、血管生成和生长。机制上，YTHDF3增强ST6GALNAC5、GJA1和EGFR等m6A富集转录本的翻译，这些转录本均与脑转移相关。此外，脑转移中YTHDF3的过表达归因于基因拷贝数增加以及YTHDF3通过结合自身5'-UTR内的m6A残基对其cap非依赖性翻译的自我调控。我们的工作揭示了YTHDF3在控制癌细胞与脑微环境相互作用中的重要作用，从而诱导脑转移能力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- YTHDF3在乳腺癌脑转移中的作用及其分子机制是什么？
- 核心机制
- YTHDF3通过结合m6A修饰的mRNA，增强ST6GALNAC5、GJA1、EGFR和VEGFA等脑转移关键基因的翻译，促进癌细胞与脑微环境相互作用；YTHDF3还通过结合自身5'-UTR的m6A残基自我调控翻译。
- 主要证据
- 体外细胞系和动物模型显示YTHDF3敲低抑制脑转移、延长生存，过表达促进脑转移；RIP-seq、CLIP、m6A-seq、多聚核糖体谱分析和RPPA鉴定靶基因及翻译调控；患者样本显示YTHDF3表达与脑转移及不良生存相关。
- 研究意义
- 揭示YTHDF3在乳腺癌脑转移中的关键作用，为脑转移治疗提供潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
YTHDF3敲低对脑转移的影响
验证YTHDF3在脑转移形成中的作用
使用shRNA敲低YTHDF3，心内注射细胞，BLI监测脑转移，生存分析
YTHDF3对脑转移各步骤的体外功能验证
确定YTHDF3影响脑转移的哪些步骤
粘附实验、Trans-BBB迁移、侵袭实验、血管生成实验、星形胶质细胞粘附
YTHDF3靶基因的鉴定
鉴定YTHDF3直接调控的脑转移相关基因
RPPA、RIP-seq、CLIP-qPCR、Western blot、多聚核糖体谱分析
m6A依赖性翻译调控验证
验证YTHDF3调控靶基因翻译依赖m6A结合
m6A-seq、YTHDF3突变体（W438A/W492A）过表达、CLIP、多聚核糖体谱分析、Western blot
YTHDF3自我调控机制研究
阐明脑转移中YTHDF3过表达的机制
拷贝数分析、RIP-seq、CLIP-qPCR、m6A-seq、报告基因实验、Western blot
体内验证YTHDF3过表达对脑转移的影响
验证YTHDF3过表达促进脑转移
YTHDF3过表达细胞心内注射和原位注射，BLI，组织病理学
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 胎牛血清 | HyClone | -- | |
| RPMI-1640培养基 | Gibco | -- | |
| Ham's F-12培养基 | -- | -- | |
| BEGM培养基 | Lonza/Clonetics Corporation | -- | |
| MCDB131培养基 | -- | -- | |
| 最低必需培养基Alpha | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 内皮细胞培养基 | Cell Biologic Inc. | M1168 | |
| 动物实验 | D-荧光素 | -- | -- |
| 基质胶 | BD Biosciences | -- | |
| CMFDA细胞追踪染料 | Thermo Fisher Scientific | C2925 | |
| 免疫荧光 | 抗GFAP抗体 | Agilent | Z0334 |
| 抗CD31抗体 | BD biosciences | 557355 | |
| 抗CK18抗体 | Abcam | ab668 | |
| Western blot | 抗YTHDF3抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-377119 |
| 抗β-actin抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | |
| 抗α-tubulin抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-5286 | |
| 抗组蛋白H3抗体 | Cell Signaling Technology | 4499 | |
| 抗FLAG M2抗体 | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| 抗ST6GALNAC5抗体 | Abcam | ab201575 | |
| 抗EGFR抗体 | Cell Signaling Technology | 4267 | |
| 抗VEGFA抗体 | Sigma-Aldrich | SAB2502119 | |
| 抗Cx43抗体 | Abcam | ab11370 | |
| m6A IP | 抗N6-甲基腺苷抗体 | Synaptic Systems | 202 003 |
| RIP | Magna RIP RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒 | Millipore | 17-700 |
| qPCR | Powerup SYBR Green PCR预混液 | Life Technologies | A25742 |
| cDNA合成 | iScript cDNA合成试剂盒 | BioRad | 1708891 |
| 血管生成实验 | 血管生成试剂盒 | Milipore | ECM625 |
| m6A定量 | EpiQuik m6A RNA甲基化定量试剂盒 | Epigentek | P-9005-48 |
| 转染 | X-tremeGENE HP DNA转染试剂 | Roche | 06366236001 |
| X-tremeGENE siRNA转染试剂 | Roche | 04476093001 | |
| 免疫沉淀 | 抗FLAG M2磁珠 | Sigma-Aldrich | M8823 |
| 细胞培养 | 层粘连蛋白 | Sigma-Aldrich | L2020-1MG |
| 大鼠尾胶原 | Corning | 354236 | |
| 免疫荧光 | Vectashield抗淬灭封片剂 | Vector laboratories | H-1000 |
| 细胞标记 | Calcein Red染料 | Thermo fisher | C34852 |
| 拷贝数分析 | YTHDF3 TaqMan基因拷贝数检测 | Applied Biosystems | 4400291 |
| TaqMan拷贝数参考检测，人RNase P | Applied Biosystems | 4403326 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 心内注射脑转移模型 | 细胞注射数量：MDA-MB-231亲本及Br细胞2.5×10^5/只，4T1亲本及Br细胞5×10^4/只，MDA-IBC3 5×10^5/只；小鼠品系和周龄 阅读提示：Methods 'In Vivo Mouse Studies' |
| YTHDF3敲低 | shRNA序列和克隆ID；两个独立shRNA；puromycin筛选浓度 阅读提示：Key Resources Table和Methods 'Plasmids and shRNA Knockdown' |
| 多聚核糖体谱分析 | 梯度制备和分馏条件； fractions collected 阅读提示：Methods 'Polysome Profiling' |
| m6A-seq | m6A抗体使用量；RNA片段化条件；peak calling参数 阅读提示：Methods 'm6A-Seq'和'Analysis of High-Throughput Sequencing Data' |
| 体外血脑屏障模型 | 原代星形胶质细胞来源和代数；bEnd.3细胞数量；共培养时间 阅读提示：Methods 'Trans-BBB Migration Assay' |