建立PI3Kα抑制剂敏感和耐药细胞及动物模型
获得对GDC-0032敏感和耐药的ER+乳腺癌模型以研究反应和耐药机制。
使用HCI-011(敏感)和HCI-001(耐药)PDTCs/PDXs，以及在T47D和MCF7中敲低或敲除PTEN构建耐药细胞系和异种移植瘤。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
代谢成像检测ER+乳腺癌中持续FOXM1表达介导的PI3Kα抑制耐药
Metabolic Imaging Detects Resistance to PI3Kα Inhibition Mediated by Persistent FOXM1 Expression in ER+ Breast Cancer.
实验完整度
高包含体外细胞系、患者来源异种移植模型、临床患者样本及RNA-seq分析，并进行功能验证和机制验证
主要模型
HCI-011和HCI-001患者来源乳腺癌细胞(PDTCs)及异种移植模型(PDXs) T47D和MCF7 ER+PIK3CA突变乳腺癌细胞系及PTEN敲低/敲除衍生株 T47D和MCF7异种移植瘤模型 POSEIDON临床试验患者肿瘤活检样本及BYL-719治疗前后配对活检样本
重点核对
GDC-0032口服给药剂量10 mg/kg，短期3次或长期5天给药/2天停药 他莫昔芬腹腔注射20 mg/kg，短期3次或长期5天给药/2天停药；氟维司群皮下注射25 mg/kg单次 超极化[1-13C]丙酮酸注射剂量0.3 mL 82 mM，7.0-T MRS采集光谱 [18F]FDG PET/CT注射12.1±1.1 MBq，注射后90-110分钟采集 细胞系药物浓度：GDC-0032 0.1 μM，BYL-719 1 μM，AZD-6482 1 μM，他莫昔芬MCF7 1 μM/T47D 2 μM，氟维司群1 μM
摘要
PIK3CA编码PI3Kα亚型，是雌激素受体(ER)阳性乳腺癌中最常见的突变癌基因。亚型选择性PI3K抑制剂已用于临床，但内在和获得性耐药限制了其效用。改进对将从这些药物中获益的患者的选择需要预测性生物标志物。我们在此表明，药物治疗后持续的FOXM1表达是ER+乳腺癌中对PI3Kα抑制耐药的生物标志物。FOXM1驱动乳酸脱氢酶(LDH)的表达但不驱动己糖激酶2(HK-II)的表达。因此，下游代谢变化可以通过MRI检测LDH催化的丙酮酸和乳酸之间的超极化13C标记交换来检测，但不能通过正电子发射断层扫描测量HK-II介导的葡萄糖类似物2-脱氧-2-[18F]氟脱氧葡萄糖的捕获来检测。使用这种成像方法快速评估乳腺癌的治疗反应可以帮助识别将从PI3Kα抑制中获益的患者，并设计药物组合以抵消耐药性的出现。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 超极化[1-13C]丙酮酸代谢成像能否检测ER+乳腺癌对PI3Kα抑制的早期反应和耐药，以及FOXM1在耐药中的作用机制是什么。
- 核心机制
- PI3Kα抑制降低FOXM1表达从而降低LDHA表达和乳酸生成；耐药时PI3K信号持续导致FOXO3a磷酸化滞留于胞质，FOXM1持续表达维持LDHA表达和丙酮酸-乳酸13C标记交换。
- 主要证据
- 在HCI-011和HCI-001 PDX及T47D PTEN敲除/敲低异种移植模型中，GDC-0032短期治疗后在肿瘤体积变化前即可通过超极化[1-13C]丙酮酸MRS检测到乳酸标记变化；FOXM1过表达或敲低实验证实其调控LDHA和耐药；[18F]FDG PET未检测到显著变化。
- 研究意义
- 超极化[1-13C]丙酮酸代谢成像可作为检测PI3Kα抑制反应和耐药的生物标志物，有助于识别受益患者并设计克服耐药的药物组合。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测PI3Kα抑制后的代谢变化
验证超极化[1-13C]丙酮酸MRS能否检测PI3Kα抑制的早期代谢反应。
在PDX和细胞系异种移植瘤中，短期GDC-0032治疗后进行超极化[1-13C]丙酮酸MRS检测乳酸/丙酮酸信号比，并行[18F]FDG PET/CT检测葡萄糖摄取。
验证FOXM1-LDHA通路在耐药中的作用
确定FOXM1是否调控LDHA表达并介导对PI3Kα抑制的耐药。
通过FOXM1过表达、敲低、ChIP、免疫印迹和LDH活性测定，以及FOXM1抑制剂FDI-6处理，检测FOXM1对LDHA表达和细胞存活的影响。
验证FOXO3a亚细胞定位机制
阐明PI3K信号调控FOXM1表达的机制。
通过免疫荧光检测FOXO3a在敏感和耐药细胞中的亚细胞定位，以及PI3Kα/β联合抑制后的变化。
评估联合治疗克服耐药的效果
测试PI3Kα抑制剂联合内分泌治疗或PI3Kβ抑制剂能否克服耐药。
在耐药细胞和异种移植瘤中，检测GDC-0032联合他莫昔芬、氟维司群或AZD-6482对细胞活力、LDHA表达和肿瘤生长的影响。
临床样本验证FOXM1表达与治疗反应的相关性
在患者样本中验证FOXM1表达与PI3Kα抑制剂反应和耐药的相关性。
对POSEIDON试验患者活检进行FOXM1免疫组化，并重新分析BYL-719治疗前后配对活检的RNA-seq数据。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 药物处理 | GDC-0032 | Selleckchem/C.C. lab. | S7103 |
| BYL-719 | Selleckchem | S2814 | |
| AZD-6482 | Selleckchem | S1462 | |
| 他莫昔芬 | Tocris Bioscience | 6342 | |
| 氟维司群 | Selleckchem | S1191 | |
| FDI-6 | Sigma | SML1392 | |
| FX-11 | Calbiochem | 427218 | |
| 多西环素盐酸盐 | Sigma | D9891 | |
| 细胞活力检测 | 阿尔玛蓝 | ThermoFisher Scientific | DAL1025 |
| Western blot | 兔单克隆抗LDHA抗体 | Cell Signaling Technology | 3582 |
| 兔单克隆抗FOXM1抗体 | Cell Signaling Technology | 5436 | |
| 兔多克隆抗HK-II抗体 | Cell Signaling Technology | 2867 | |
| 兔多克隆抗磷酸化Akt (S473)抗体 | Cell Signaling Technology | 9271 | |
| 兔多克隆抗Akt抗体 | Cell Signaling Technology | 9272 | |
| 兔多克隆抗磷酸化S6 (S235/236)抗体 | Cell Signaling Technology | 2211 | |
| 兔多克隆抗PTEN抗体 | Cell Signaling Technology | 9552 | |
| 免疫荧光 | 兔多克隆抗FOXO3a抗体 | Cell Signaling Technology | 2497 |
| 免疫组化 | 兔多克隆抗FOXM1抗体(免疫组化) | Cell Signaling Technology | 20459 |
| ChIP | 兔多克隆抗FOXM1抗体(ChIP) | GeneTex | GTX100276 |
| 流式细胞术 | 鼠单克隆PE抗人CD298抗体 | Biolegend | 341704 |
| 鼠单克隆APC抗I类(H-2Kd)抗体 | ThermoFisher Scientific | 114613 | |
| 超极化MRS | OX063三苯甲基自由基 | GE Healthcare | -- |
| Dotarem钆螯合物 | Guerbet | -- | |
| PET/CT | 2-脱氧-2-[18F]氟脱氧葡萄糖 | Alliance Medical | -- |
| 动物实验 | 17β-雌二醇0.72mg/90天释放 pellet | Innovative Research of America | NE-121 |
| 肿瘤消化 | 人肿瘤解离试剂盒 | ThermoFisher Scientific | 130-095-929 |
| RNA提取 | RNAeasy试剂盒 | QIAGEN | 74104 |
| RT-qPCR | SuperScript II逆转录酶 | ThermoFisher Scientific | 18064014 |
| RNA-seq | TruSeq链特异性mRNA高通量样本制备试剂盒 | Illumina | RS-122-2103 |
| Western blot | RIPA裂解液 | Pierce | 89901 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 11836170001 | |
| ECL Prime试剂 | Amersham | -- | |
| 免疫荧光 | 含DAPI的ProLong Gold抗淬灭封片剂 | ThermoFisher Scientific | P36935 |
| 细胞培养 | 基质胶 | BD Biosciences | 356231 |
| 流式细胞术 | eBioscience可固定活性染料eFluor 455UV | ThermoFisher Scientific | 65-0868-14 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞系与药物处理 | 细胞系来源(T47D、MCF7、MDAMB231、MDAMB468)及药物浓度(GDC-0032 0.1 μM、BYL-719 1 μM、AZD-6482 1 μM、他莫昔芬MCF7 1 μM/T47D 2 μM、氟维司群1 μM、FDI-6 5 μM、多西环素100 ng/ml、FX-11 10 μM) 阅读提示：STAR Methods中Cell Lines小节及Key Resources Table |
| PDX和异种移植模型建立 | PDX来源(HCI-001、HCI-011)、NSG小鼠周龄(6-8周)、雌激素 pellet(0.72 mg/90天)、肿瘤体积范围(200-300 mm3用于长期治疗，500-1000 mm3用于成像) 阅读提示：STAR Methods中Xenografts小节 |
| 体内药物给药方案 | GDC-0032口服10 mg/kg每日一次(短期3次，长期5天给药/2天停药)；他莫昔芬腹腔注射20 mg/kg(短期3次，长期5天给药/2天停药)；氟维司群皮下25 mg/kg单次；溶剂(0.5%甲基纤维素/0.2% Tween-80或玉米油) 阅读提示：STAR Methods中Xenografts小节及Figure legends 1E、2C |
| 超极化[1-13C]丙酮酸MRS | 丙酮酸剂量(0.3 mL 82 mM)、极化仪(3.35-T Oxford Instruments Hypersense)、MRS场强(7.0-T Agilent)、翻转角5°、层厚6-10 mm、采集时间3分钟 阅读提示：STAR Methods中13C Magnetic Resonance Spectroscopy小节及Figure 1E/2C |
| [18F]FDG PET/CT | FDG剂量(12.1±1.1 MBq)、注射后采集时间(90-110分钟)、NanoPET/CT扫描仪、禁食4-8小时 阅读提示：STAR Methods中[18F]FDG PET/CT小节 |
| FOXM1敲低体内实验 | 多西环素饲料浓度(0.2 g/kg食物颗粒，Harlan D.98186)、shFOXM1序列、T47D PTEN KO异种移植瘤 阅读提示：STAR Methods中Xenografts小节及Figure 7I |