小鼠肺腺癌演化时间序列单细胞转录组分析
描绘从癌前病变到腺癌的细胞状态多样性及其可重复性。
在K、KP、KPT小鼠中诱导肿瘤，于2、12、20、30周分离tdTomato+肿瘤细胞进行SMART-Seq2 scRNA-Seq，聚类并分析异质性。
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肺癌演化过程中高可塑性细胞状态的出现
Emergence of a High-Plasticity Cell State during Lung Cancer Evolution.
实验完整度
高包含小鼠肿瘤模型、体外3D培养、体内移植、单细胞多组学及人源样本验证，并进行了功能与机制验证。
主要模型
KrasLSL-G12D; Trp53flox/flox (KP/KPT) 小鼠肺腺癌模型 KrasLSL-G12D (K/KT) 小鼠肺腺癌模型 人肺腺癌患者来源异种移植 (PDX) 模型 人肺腺癌组织样本和scRNA-Seq数据
重点核对
TIGIT+和TIGIT-细胞从20周KP/KPT肺肿瘤中FACS分选，TIGIT+定义为HPCS富集 3D肿瘤球培养11天，每孔接种<1000细胞，比较TIGIT+、CD109+和TIGIT-细胞 原位同种移植：TIGIT+或TIGIT-细胞（18-21周肿瘤）移植到NSG小鼠，28,000或50,000细胞/小鼠，8周或39天后分析 顺铂处理：20周KPT荷瘤小鼠腹腔注射7 mg/kg，72小时后scRNA-Seq 人PDX模型：Integrin α2Hi（前15%）和α2Lo细胞分选，3D培养22天，比较肿瘤球形成
摘要
从单细胞到恶性异质性组织的肿瘤演化过程仍知之甚少。在此，我们对基因工程小鼠肺肿瘤七个阶段（从癌前增生到腺癌）的单细胞转录组进行了分析。转录状态的多样性随时间增加，并在不同肿瘤和小鼠间可重复。癌细胞逐步采用替代的谱系身份，计算预测这通过一个共同的过渡性高可塑性细胞状态（HPCS）介导。因此，从小鼠肿瘤和 human 患者来源异种移植中前瞻性分离的 HPCS 细胞显示出高分化 and 增殖能力。HPCS 程序与多种人类癌症的不良生存相关，并在小鼠中表现出化疗耐药。我们的研究揭示了支撑瘤内异质性的中心原则，并激发对 HPCS 的治疗靶向。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肺腺癌演化过程中细胞状态多样性如何产生、是否可重复，以及是否存在驱动异质性的关键细胞状态。
- 核心机制
- 癌细胞通过一个高可塑性细胞状态（HPCS）进行状态转换，该状态具有高分化和增殖潜能，并可产生包括EMT在内的多种细胞状态。
- 主要证据
- 小鼠肺肿瘤时间序列scRNA-Seq显示转录状态多样性增加且可重复；Waddington-OT预测cluster 5为过渡枢纽；TIGIT+ HPCS细胞在体外和体内均显示更高的分化多样性和成瘤能力；HPCS与化疗耐药和不良生存相关。
- 研究意义
- 揭示了HPCS是瘤内异质性和治疗抵抗的关键驱动因素，提示靶向HPCS可能成为抑制肿瘤异质性和耐药的策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
拷贝数变异与转录状态的关联分析
检验遗传异质性是否驱动表型多样性。
从scRNA-Seq推断CNV，并对部分KPT肿瘤进行scDNA-Seq，比较CNV克隆型与转录簇的对应关系。
HPCS的鉴定与表面标志物验证
识别并前瞻性分离HPCS细胞。
通过NMF和Waddington-OT预测cluster 5为高塑性状态，发现TIGIT为表面标志物，用FACS分离TIGIT+和TIGIT-细胞，qPCR验证。
HPCS的体外分化潜能评估
验证HPCS细胞是否具有高分化和增殖能力。
将TIGIT+、CD109+和TIGIT-细胞进行3D肿瘤球培养11天，scRNA-Seq分析后代多样性。
HPCS的体内成瘤和分化潜能验证
验证HPCS细胞在体内的肿瘤起始和分化能力。
将TIGIT+和TIGIT-细胞原位移植到NSG小鼠肺部，观察肿瘤生长和转录多样性。
HPCS的化疗耐药性评估
检验HPCS细胞在化疗后的富集情况。
对20周KPT荷瘤小鼠给予顺铂，72小时后scRNA-Seq，比较细胞簇组成变化。
人肺腺癌中HPCS样状态的验证
检验小鼠HPCS发现是否适用于人肺腺癌。
分析人LUAD scRNA-Seq数据，免疫组化检测标志物，从PDX分离Integrin α2Hi/α2Lo细胞进行3D培养和scRNA-Seq。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 基质胶 | Corning | CB-40230C |
| Advanced DMEM/F12培养基 | Gibco | 12634028 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140163 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 庆大霉素 | Gibco | 15750-060 | |
| 组织解离 | 肺组织解离试剂盒 | Miltenyi Biotech | 130-095-927 |
| 肿瘤解离试剂盒 | Miltenyi Biotech | 130-095-929 | |
| 分散酶II | Gibco | 17105-041 | |
| IV型胶原酶 | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | 69182-3 | |
| 流式细胞术 | 大鼠抗小鼠CD16/CD32单克隆抗体 | BD Biosciences | 553142 |
| 大鼠抗小鼠CD45单克隆抗体，APC | BD Biosciences | 559864 | |
| 大鼠抗小鼠CD31单克隆抗体，APC | BD Biosciences | 561814 | |
| 大鼠抗小鼠CD11b单克隆抗体，APC | BD Biosciences | 561690 | |
| 大鼠抗小鼠TER-119单克隆抗体，APC | BD Biosciences | 561033 | |
| 小鼠抗小鼠TIGIT，BV421 | Biolegend | 142111 | |
| 小鼠抗人CD49b（整合素α2），APC | Biolegend | 359309 | |
| 单细胞RNA测序 | Agencourt RNAClean XP磁珠 | Beckman Coulter | A63881 |
| Maxima逆转录酶 | Thermo Fischer | EP0752 | |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| Nextera XT文库制备试剂盒 | Illumina | FC-131-1096 | |
| 单细胞DNA测序 | GenomePlex单细胞全基因组扩增试剂盒 | Sigma | 254-457-8 |
| 单细胞ATAC测序 | Chromium单细胞ATAC文库试剂盒v1 | 10x Genomics | PN-1000083 |
| 化疗处理 | 顺铂 | EMD-Millipore | 232120 |
| 生物发光成像 | D-荧光素 | Perkin Elmer | 122799 |
| qPCR | Powerup SYBR预混液 | Applied Biosystems | A25778 |
| 免疫荧光 | 兔抗Claudin 4 | Invitrogen | 36-4800 |
| 小鼠抗Claudin 2 | Invitrogen | 32-5600 | |
| 兔抗溶菌酶 | DAKO | A0099 | |
| 兔抗整合素α2 | Abcam | 181548 | |
| RNAscope | RNAscope 2.5 HD检测试剂-红色 | ACDBio | 322360 |
| Slc4a11小鼠原位杂交探针 | ACDBio | 559521 | |
| Tigit小鼠原位杂交探针 | ACDBio | 319751 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠肺腺癌演化scRNA-Seq | 小鼠模型基因型（K、KP、KPT）、肿瘤诱导时间点（2、12、20、30周）、细胞分选标志（tdTomato+/CD45-/CD11b-/TER119-/CD31-）、scRNA-Seq平台（SMART-Seq2） 阅读提示：Methods: Isolating cells from lung adenocarcinomas; Plate-based scRNA-Seq; Figure 1A-C |
| HPCS细胞分选 | 肿瘤周龄（20周）、分选标志（TIGIT+ vs TIGIT-，EpCAM+）、验证方法（qPCR for Tigit, Slc4a11, Epcam） 阅读提示：Methods: FACS; Results: The LUAD cell subset comprising the HPCS can be prospectively isolated based on TIGIT expression; Figure S3D |
| 3D肿瘤球培养 | 细胞来源（17-22周KP/KPT LUAD）、接种密度（<1000细胞/孔）、培养时间（11天）、培养基（Advanced DMEM/F12 + 2% FBS + 添加剂） 阅读提示：Methods: Mouse 3-dimensional tumor sphere cultures; Figure 4B; Figure 5A |
| 原位移植实验 | 细胞来源（18-21周KP LUAD）、移植细胞数（28,000或50,000/小鼠）、受体鼠（NSG，8-35周龄）、分析时间（8周或39天） 阅读提示：Methods: Generation of orthotopic mouse LUAD allotransplants; In vivo bioluminescence; Figure 4E; Figure 5C |
| 顺铂化疗实验 | 肿瘤周龄（20周）、顺铂剂量（7 mg/kg）、给药途径（腹腔注射）、分析时间（72小时）、对照（vehicle） 阅读提示：Methods: Chemotherapy; Figure 5F-H |
| 人PDX肿瘤球培养 | PDX模型（MSK-LX984, MSK-LX1012, MSK-LX1182）、分选标志（Integrin α2Hi vs α2Lo）、接种密度（up to 10,000细胞/孔）、培养时间（22天） 阅读提示：Methods: Human 3-dimensional tumor sphere cultures; Isolation of LUAD PDX tumor spheres; Figure 7C |