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        综合分子特征分析揭示肾髓质癌独特的基因组和免疫标志

        Comprehensive Molecular Characterization Identifies Distinct Genomic and Immune Hallmarks of Renal Medullary Carcinoma.

        作者信息Pavlos Msaouel, Gabriel G Malouf, Xiaoping Su, Hui Yao, Durga N Tripathi, Melinda Soeung, Jianjun Gao, Priya Rao, Cristian Coarfa, Chad J Creighton, Jean-Philippe Bertocchio, Selvi Kunnimalaiyaan, Asha S Multani, Jorge Blando, Rong He, Daniel D Shapiro, Luigi Perelli, Sanjana Srinivasan, Federica Carbone, Patrick G Pilié, Menuka Karki, Riyad N H Seervai, Bujamin H Vokshi, Dolores Lopez-Terrada, Emily H Cheng, Ximing Tang, Wei Lu, Ignacio I Wistuba, Timothy C Thompson, Irwin Davidson, Virginia Giuliani, Katharina Schlacher, Alessandro Carugo, Timothy P Heffernan, Padmanee Sharma, Jose A Karam, Christopher G Wood, Cheryl L Walker, Giannicola Genovese, Nizar M Tannir
        PMID32359397
        期刊Cancer Cell
        发布时间2020-05-11
        DOI10.1016/j.ccell.2020.04.002
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        含患者原发肿瘤基因组/转录组测序、细胞系功能实验、类器官？无，PDX体内药效及机制验证

        主要模型

        38例患者RMC肿瘤样本及配对正常肾组织 RMC2C和RMC219细胞系 RMC2X患者来源异种移植（PDX）小鼠模型

        重点核对

        WES平均靶覆盖度：肿瘤73×，配对正常60×；估计肿瘤纯度均值49.1%（范围24%–98%） SMARCB1免疫组化阴性确认所有RMC样本；FISH、MLPA和WES联合检测SMARCB1失活 细胞活力实验：药物浓度0.01–20 μM，处理120小时后MTT检测，每组3个独立孔 PDX体内实验：尼拉帕利50 mg/kg/天口服，AZD6738 25 mg/kg/天口服，给药5天休2天共25天 PDX体内实验：顺铂1.25 mg/kg每周腹腔注射，共3周；尼拉帕利50 mg/kg/天口服

        摘要

        肾髓质癌（RMC）是一种高度致命的恶性肿瘤，主要影响非洲裔年轻个体，并且对所有用于治疗其他肾细胞癌的靶向药物均耐药。为阐明这些肿瘤的分子特征，我们对未经治疗的初发RMC组织进行了全面的基因组和转录组分析。我们发现RMC的特征是高复制应激以及大量局灶性拷贝数改变，这些改变与环鸟苷酸-腺苷酸合成酶-干扰素基因（cGAS-STING）先天免疫通路的激活相关。复制应激使RMC对靶向DNA损伤修复通路的药物产生治疗易感性。这些此前未知的RMC标志的阐明为这一罕见但高度致命恶性肿瘤的新临床试验铺平了道路。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        阐明肾髓质癌（RMC）的分子图景，并识别可用于治疗干预的独特基因组和免疫标志。
        核心机制
        SMARCB1缺失增加c-MYC与DNA复制和细胞周期进展相关基因启动子的结合，加速复制叉进程并诱导复制应激和DNA损伤反应；局灶性拷贝数改变与cGAS-STING先天免疫通路激活相关。
        主要证据
        对31例未经治疗初发RMC行WES、11例行RNA-seq，并结合FISH、MLPA、CGH和DNA甲基化分析；在RMC2C、RMC219、G401和VA-ES-BJ细胞中通过SMARCB1回补、c-MYC siRNA、ChIP-qPCR和DNA纤维实验验证；在RMC2X PDX小鼠模型中验证PARP抑制剂尼拉帕利单用及联合顺铂的体内抗肿瘤效果。
        研究意义
        揭示RMC此前未知的标志，为这一罕见但高度致命恶性肿瘤开展靶向复制应激和免疫检查点治疗的新临床试验提供依据。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        患者队列与肿瘤样本分子图谱建立

        确定RMC的突变负荷、拷贝数改变和转录组特征，并与其他肾恶性肿瘤区分。

        获取38例RMC、9例CDC和22例UTUC患者的肿瘤样本；对31例未经治疗初发RMC行WES，对11例RMC行RNA-seq，并以配对正常肾组织及CDC、UTUC、肾MRT和TCGA肾癌数据作比较。

        2

        SMARCB1失活机制验证

        明确RMC中SMARCB1失活的遗传学机制。

        联合FISH、WES/靶向测序和MLPA检测未经治疗初发RMC样本中的SMARCB1改变，并用Sanger测序确认融合转录本；对无遗传学SMARCB1丢失的样本行DNA甲基化分析。

        3

        免疫微环境与cGAS-STING通路表征

        刻画RMC的免疫细胞浸润和免疫检查点表达，并验证cGAS-STING通路激活。

        对RNA-seq数据行MCP-counter解卷积分析免疫和基质细胞群，并用免疫组化检测CD3、CD4、CD8、CD20、CD68、FOXP3、PD-1、PD-L1和STING。

        4

        SMARCB1缺失诱导c-MYC相关复制应激的机制验证

        验证SMARCB1缺失通过c-MYC诱导复制应激和DNA损伤反应的因果链。

        在RMC2C、RMC219、G401和VA-ES-BJ细胞中回补SMARCB1或用siRNA抑制c-MYC，行Western blot检测复制应激和DNA损伤反应蛋白；在RMC2C细胞中行ChIP-qPCR检测c-MYC启动子结合；在HEK-293FT细胞中行CRISPR/Cas9敲除SMARCB1并行DNA纤维实验。

        5

        靶向复制应激药物的体外敏感性评估

        评估SMARCB1缺失细胞对PARP、ATR和WEE1抑制剂的敏感性，以及SMARCB1回补或c-MYC抑制对敏感性的影响。

        用MTT法检测SMARCB1阴性细胞系（RMC2C、RMC219、G401、CHLA-06-ATRT）和SMARCB1阳性肾癌细胞系（786-O、RCC4、A-498）对奥拉帕利、尼拉帕利、VX970、AZD6738和adavosertib的活力反应。

        6

        PARP抑制剂体内抗肿瘤效果验证

        在体内验证靶向PARP通路单用及联合铂类化疗对RMC的抗肿瘤效果。

        使用RMC2X皮下PDX模型，将荷瘤小鼠随机分组接受尼拉帕利、AZD6738、两药联合或溶媒对照，以及尼拉帕利联合顺铂或各自对照。

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        验证样本或模型特征
        全外显子组测序RNA测序荧光原位杂交多重连接依赖探针扩增比较基因组杂交芯片Sanger测序DNA甲基化芯片光谱核型分析G显带
        验证分子表达变化
        蛋白质印迹免疫组织化学免疫荧光染色免疫共沉淀染色质免疫沉淀-定量PCR染色质免疫沉淀测序分析
        验证细胞功能变化
        MTT法DNA纤维实验siRNA敲低CRISPR/Cas9敲除短串联重复DNA图谱分析
        评估体内效果
        患者来源异种移植模型肿瘤体积测量
        数据分析与统计
        基因集富集分析基因本体分析MCP-counter解卷积分析GISTIC2.0分析突变特征分析Kaplan-Meier生存分析

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        免疫组化小鼠单克隆抗BAF47（抗SMARCB1）克隆25BD Biosciences612111
        Western blot小鼠单克隆抗INI1/SNF5（抗SMARCB1）抗体克隆2C2Sigma-AldrichSAB4200202
        兔多克隆抗磷酸化组蛋白H2A.X（丝氨酸139）抗体Cell Signaling Technology2577
        小鼠单克隆抗c-MYC抗体9E10Santa Cruz Biotechnologysc-40
        兔多克隆抗PARP抗体Cell Signaling Technology9542
        山羊多克隆抗ATR抗体Santa Cruz Biotechnologysc-1887
        兔多克隆抗磷酸化ATR（丝氨酸428）抗体Cell Signaling Technology2853
        小鼠单克隆抗TP53抗体Santa Cruz Biotechnologysc-126
        兔多克隆抗磷酸化TP53（丝氨酸15）抗体Cell Signaling Technology9284
        小鼠单克隆抗肌动蛋白抗体Santa Cruz Biotechnologysc-47778 HRP
        兔多克隆抗磷酸化CDK1（酪氨酸15）抗体Cell Signaling Technology9111
        小鼠单克隆抗RPA 32 kDa亚基9H8抗体Santa Cruz Biotechnologysc-56770
        兔多克隆抗磷酸化RPA32（丝氨酸4和8）抗体BethylA300–245A
        小鼠单克隆抗FANCD2抗体Santa Cruz Biotechnologysc-20022
        免疫共沉淀兔多克隆抗PBRM1抗体BethylA301–591A
        兔单克隆抗BRG1（抗SMARCA4）抗体Abcamab110641
        小鼠单克隆抗BAF250a（抗ARID1A）抗体Santa Cruz Biotechnologysc-32761
        免疫组化兔单克隆抗STING抗体Cell Signaling Technology13647
        兔多克隆抗CD3抗体AgilentA0452
        小鼠单克隆抗CD4抗体Leica BiosystemsNCL-L-CD4–368
        小鼠单克隆抗CD8抗体Thermo Fisher ScientificMS-457-S
        小鼠单克隆抗FOXP3抗体BioLegend320102
        小鼠单克隆抗CD20抗体AgilentM0755
        小鼠单克隆抗CD68抗体AgilentM0876
        兔单克隆抗PD-L1抗体Cell Signaling Technology13684
        兔单克隆抗PD-1抗体AbcamAB201825
        ChIP-qPCR兔多克隆抗c-MYC抗体Santa Cruz Biotechnologysc-764
        兔正常IgG对照抗体Cell Signaling Technology2729
        DNA纤维实验小鼠单克隆抗IdU/抗BrdU克隆B44抗体BD BiosciencesB44
        大鼠单克隆抗CldU/抗BrdU（BU1/75 ICR1）抗体Santa Cruz Biotechnologysc-56258
        山羊多克隆抗小鼠Alexa Fluor 488抗体Thermo Fisher ScientificA-11001
        山羊多克隆抗大鼠Alexa Fluor 555抗体Thermo Fisher ScientificA-21434
        质粒扩增大肠杆菌DH5αInvitrogen18265017
        药物处理多西环素Thermo Fisher Scientific10592-13-9
        奥拉帕利Selleckchem763113-22-0
        尼拉帕利Selleckchem1038915-60-4
        VX970Selleckchem1232416–25-9
        AZD6738Selleckchem1352226-88-0
        adavosertibSelleckchem955365-80-7
        多柔比星UTMDACC Department of Pharmacy23214-92-8
        吉西他滨UTMDACC Department of Pharmacy95058-81-4
        卡铂UTMDACC Department of Pharmacy41575-94-4
        顺铂UTMDACC Department of Pharmacy15663-27-1
        紫杉醇UTMDACC Department of Pharmacy33069-62-4
        细胞培养通用支原体检测试剂盒ATCC30-1012K
        DNA提取QIAamp DNA FFPE组织试剂盒（50次）Qiagen56404
        DNA/RNA提取AllPrep DNA/RNA微型试剂盒（50次）Qiagen80204
        全外显子组测序SureSelectXT试剂盒AgilentG9612B
        4200 TapeStation高灵敏度D1000 ScreenTapeAgilent5067-5584
        Qubit dsDNA HS检测试剂盒Thermo Fisher ScientificQ32851
        KAPA文库定量试剂盒RocheKK4824
        靶向DNA测序FoundationOne CDxFoundation MedicineF1CDX
        RNA提取RNeasy微型试剂盒（250次）Qiagen74106
        DNA甲基化分析Infinium HumanMethylation450（HM450）BeadChip芯片IlluminaWG-314-1002
        EZ DNA甲基化试剂盒Zymo ResearchD5001
        FISHSMARCB1BA-20-GROR断裂分离FISH探针Empire GenomicsSMARCB1BA-20-GROR
        MLPASALSA MLPA P258（SMARCB1）试剂盒MRC-HollandP258-050R
        光谱核型分析HiSKY探针试剂盒Applied Spectral ImagingFPRPR0028
        siRNA敲低siGENOME人MYC siRNA SMARTpoolHorizon DiscoveryM-003282-07-0010
        siGENOME非靶向siRNA对照池Horizon DiscoveryD-001206-13-20
        细胞活力检测细胞增殖试剂盒I（MTT）Sigma-Aldrich11 465 007 001

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        患者队列与测序
        RMC患者数38例；WES样本31例肿瘤+15例配对正常；RNA-seq 11例RMC、9例CDC、22例UTUC、6例正常肾；测序覆盖度及肿瘤纯度
        阅读提示：STAR Methods中Tumor samples、WES and targeted DNA sequencing、RNA sequencing小节，Figure 1及Supplementary Table 1、2、4
        SMARCB1失活检测
        FISH断裂分离阳性阈值≥15%肿瘤核；部分缺失定义；全等位缺失定义；MLPA重复次数；甲基化β值判定阈值
        阅读提示：STAR Methods中Fluorescence in situ hybridization (FISH)、MLPA、DNA methylation analysis小节，Figure 3及Supplementary Table 3
        免疫微环境分析
        MCP-counter输入为RNA-seq数据；IHC抗体稀释比例；STING IHC定量样本量（RMC 20例，正常肾12例，MRT 12例）
        阅读提示：STAR Methods中Deconvolution of tissue-infiltrating immune and stromal cell populations、Immunohistochemistry小节，Figure 5及Supplementary Table 5
        SMARCB1回补与c-MYC敲低
        多西环素0.5 μg/mL处理3天（回补）或5天（Western blot）；c-MYC siRNA 10 nM处理72小时；细胞系来源与传代数
        阅读提示：STAR Methods中SMARCB1 re-expression experiments、Small interfering RNA (siRNA) knockdown、Western blot analyses小节，Figure 6D、6E、7C、7D
        体外药物敏感性
        细胞接种密度5.0×10^3/孔；药物浓度0.01–20 μM；处理120小时；每组3孔、至少3次独立实验；IC50拟合软件
        阅读提示：STAR Methods中Cell viability experiments小节，Figure 7A、7B及图注
        PDX体内药效
        小鼠品系CB17/lcr-Prkdscid/lcrlcoCrl，6–9周龄雌性；每组n=5或n=10；尼拉帕利50 mg/kg/天，AZD6738 25 mg/kg/天，顺铂1.25 mg/kg每周腹腔注射；给药5天休2天共25天；起始肿瘤体积100–200 mm3
        阅读提示：STAR Methods中In vivo treatments、Mouse Studies小节，Figure 7E、7F及图注

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