一种棕榈酰转移酶化学遗传系统用于绘制ZDHHC特异性S-酰化图谱

A palmitoyl transferase chemical-genetic system to map ZDHHC-specific S-acylation.

作者信息Cory A Ocasio, Marc P Baggelaar, James Sipthorp, Ana Losada de la Lastra, Manuel Tavares, Jana Volarić, Christelle Soudy, Elisabeth M Storck, Jack W Houghton, Susana A Palma-Duran, James I MacRae, Goran Tomić, Lotte Carr, Julian Downward, Ulrike S Eggert, Edward W Tate

PMID38191663

期刊Nat Biotechnol

发布时间2024-10

DOI10.1038/s41587-023-02030-0

来源查看原文

实验完整度

高

包含体外纯化酶动力学、多种细胞系化学蛋白质组学、位点突变验证及诱导表达系统等多个独立证据层级，并有功能与机制验证。

主要模型

HEK293T细胞 MDA-MB-231细胞 PANC1细胞 Flp-In T-REx HEK293细胞

重点核对

18-Bz探针浓度15 μM、处理时间8 h用于ZDHHC20(Y181G)化学蛋白质组学 ZDHHC20(Y181G)与WT ZDHHC20在HEK293T细胞中比较以鉴定选择性底物 18-Bz-CoA与YnPal-CoA对纯化ZDHHC20 WT和Y181G的酶动力学参数测定 S-酰化位点通过半胱氨酸点突变（如STX7 C28A/C239A、VAMP3 C76A、BCAP31 C23A）验证 Flp-In T-REx HEK293细胞中多西环素诱导ZDHHC20(Y181G)表达水平约降低8倍

摘要

23种人类锌指Asp-His-His-Cys基序（ZDHHC）S-酰基转移酶在广泛网络中催化数百种对正常生理重要或疾病中失调的蛋白质的半胱氨酸残基上的长链S-酰化。在此，我们提出一种技术，可在完整细胞中在全蛋白质组水平直接绘制特定ZDHHC的蛋白质底物。对配对的ZDHHC“孔”突变体和“凸起”化学标记脂肪酸探针进行结构指导的工程化改造，使探针能够以优于野生型ZDHHC的优异选择性转移至特定蛋白质底物。化学-遗传系统在五种人类ZDHHC（3、7、11、15和20）中得到例证，并应用于生成从头ZDHHC底物谱，在多个细胞系中鉴定出超过300种底物和S-酰化位点，涉及功能多样的新蛋白质。我们预期该平台将为广泛的模型和生物体阐明S-酰化生物学。

设计并筛选ZDHHC20“孔”突变体与“凸起”探针配对

获得对ZDHHC20(Y181G)具有高选择性和高装载效率的探针。

基于ZDHHC20结构设计Y181G等“孔”突变体，合成含炔基和不同“凸起”基团（Ac、cPr、Bz）及不同链长（16、18、20原子）的脂肪酸探针，在HEK293T细胞中进行代谢标记和点击化学荧光检测，筛选最佳突变体/探针组合。

体外酶动力学验证正交催化效率

验证“凸起”探针被ZDHHC20(Y181G)特异性活化的生化基础。

使用FLAG纯化的WT ZDHHC20或ZDHHC20(Y181G)，以18-Bz-CoA和YnPal-CoA为底物，通过α-酮戊二酸脱氢酶偶联的实时荧光 assay 测定CoA生成速率，计算Michaelis-Menten动力学参数。

化学蛋白质组学鉴定ZDHHC20底物及S-酰化位点

在全蛋白质组水平鉴定ZDHHC20(Y181G)特异性标记的底物和S-酰化位点。

在HEK293T、MDA-MB-231和PANC1细胞中表达WT ZDHHC20或ZDHHC20(Y181G)，用18-Bz探针标记，点击化学连接生物素，富集后经on-bead水解和LC-MS/MS进行定量蛋白质组学分析。

S-酰化位点验证

确认新鉴定底物的S-酰化位点。

对STX7、VAMP3、BCAP31、PTRH2等底物的半胱氨酸进行丙氨酸扫描突变，在HEK293T细胞中与ZDHHC20(Y181G)共表达，用18-Bz标记后通过点击化学和荧光检测验证位点依赖性。

诱导型低表达系统的化学遗传标记

评估在较低ZDHHC20表达水平下化学遗传标记的选择性和效率。

建立Flp-In T-REx HEK293细胞系，多西环素诱导表达WT ZDHHC20或ZDHHC20(Y181G)，用18-Bz标记并进行化学蛋白质组学分析。

扩展至其他ZDHHC家族成员

将化学遗传系统应用于ZDHHC3、7、11和15。

基于同源建模设计各ZDHHC的“孔”突变体，合成不同链长和“凸起”的探针，在HEK293T细胞中进行两阶段筛选，获得优化突变体/探针配对，并进行化学蛋白质组学底物谱分析。

实验环节	名称	品牌	货号
细胞培养	杜尔贝科改良伊格尔培养基	Thermo Fisher Scientific	10566016
青霉素-链霉素	Thermo Fisher Scientific	15140122
杀稻瘟菌素S盐酸盐	Thermo Fisher Scientific	A1113903
潮霉素B	Thermo Fisher Scientific	10687010
化学标记	炔基棕榈酸	2BScientific	BCAL-015-25
TAMRA叠氮化物	Sigma-Aldrich	760757
生物素PEG3叠氮化物	Sigma-Aldrich	762024
三((1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)胺	Sigma-Aldrich	678937
palmostatin B	Sigma-Aldrich	178501
酶动力学	棕榈酰辅酶A	Sigma-Aldrich	P9716
α-酮戊二酸脱氢酶	Sigma-Aldrich	K1502
免疫沉淀	抗FLAG M2磁珠	Sigma-Aldrich	M8823
Pierce抗HA磁珠	Life Technologies	88836
蛋白质组学	NeutrAvidin琼脂糖珠	Thermo Fisher Scientific	29200
胰蛋白酶	Promega	V5111
赖氨酸C端酶	Promega	VA1170
转染	FuGene HD转染试剂	Promega	E2311
Lipofectamine CRISPRMAX试剂	Thermo Fisher Scientific	CMAX00001
TrueCut Cas9 v2蛋白	Thermo Fisher Scientific	A36496
Western blot	Clarity Western ECL底物	Bio-Rad	1705061
抗FLAG M2抗体	Sigma-Aldrich	F1804
抗HA抗体（HA-7）	Sigma-Aldrich	H3663
抗α-微管蛋白抗体	Sigma-Aldrich	T5168
抗ZDHHC20抗体	Atlas Antibodies	HPA014702
抗钙联蛋白抗体	Abcam	ab22595
免疫荧光	Gm130抗体	Abcam	ab52649
抗泛钙黏蛋白抗体	Abcam	ab51034
脂质组学	M-PER哺乳动物蛋白提取试剂	Thermo Fisher Scientific	78501
Pierce BCA蛋白测定试剂盒	Thermo Fisher Scientific	23227

实验环节

名称

品牌

货号

细胞培养

杜尔贝科改良伊格尔培养基

Thermo Fisher Scientific

10566016

青霉素-链霉素

Thermo Fisher Scientific

15140122

杀稻瘟菌素S盐酸盐

Thermo Fisher Scientific

A1113903

潮霉素B

Thermo Fisher Scientific

10687010

化学标记

炔基棕榈酸

2BScientific

BCAL-015-25

TAMRA叠氮化物

Sigma-Aldrich

760757

生物素PEG3叠氮化物

Sigma-Aldrich

762024

三((1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)胺

Sigma-Aldrich

678937

palmostatin B

Sigma-Aldrich

178501

酶动力学

棕榈酰辅酶A

Sigma-Aldrich

P9716

α-酮戊二酸脱氢酶

Sigma-Aldrich

K1502

免疫沉淀

抗FLAG M2磁珠

Sigma-Aldrich

M8823

Pierce抗HA磁珠

Life Technologies

88836

蛋白质组学

NeutrAvidin琼脂糖珠

Thermo Fisher Scientific

29200

胰蛋白酶

Promega

V5111

赖氨酸C端酶

Promega

VA1170

转染

FuGene HD转染试剂

Promega

E2311

Lipofectamine CRISPRMAX试剂

Thermo Fisher Scientific

CMAX00001

TrueCut Cas9 v2蛋白

Thermo Fisher Scientific

A36496

Western blot

Clarity Western ECL底物

Bio-Rad

1705061

抗FLAG M2抗体

Sigma-Aldrich

F1804

抗HA抗体（HA-7）

Sigma-Aldrich

H3663

抗α-微管蛋白抗体

Sigma-Aldrich

T5168

抗ZDHHC20抗体

Atlas Antibodies

HPA014702

抗钙联蛋白抗体

Abcam

ab22595

免疫荧光

Gm130抗体

Abcam

ab52649

抗泛钙黏蛋白抗体

Abcam

ab51034

脂质组学

M-PER哺乳动物蛋白提取试剂

Thermo Fisher Scientific

78501

Pierce BCA蛋白测定试剂盒

Thermo Fisher Scientific

23227

环节	核对要点
ZDHHC20化学遗传标记与底物鉴定	探针浓度15 μM、处理时间8 h、细胞系（HEK293T、MDA-MB-231、PANC1）、转染质粒量1–2 μg、统计标准（S0=0.5，FDR=0.01，n=4）阅读提示：Methods中“Cellular ZDHHC-autoacylation and substrate transfer”及“On-bead hydrolysis proteomics”小节；Fig. 3b图注
体外酶动力学测定	ZDHHC20浓度20 nM、底物浓度范围、KDH用量2 μl、反应缓冲液组成、18-Bz-CoA背景速率扣除阅读提示：Methods中“ZDHHC20 enzyme kinetic mutant and probe analysis”小节；Extended Data Fig. 2
S-酰化位点验证	突变位点（STX7 C28A/C239A、VAMP3 C76A、BCAP31 C23A、PTRH2 C28A）、探针浓度15 μM、处理时间4 h或24 h、n=3 阅读提示：Fig. 4及Extended Data Fig. 6g,h图注；Methods中“Mutagenesis”小节
诱导型低表达系统	多西环素浓度1 μg/ml、诱导时间24 h、探针浓度15 μM、处理时间8 h或24 h、n=4 阅读提示：Methods中“TREX HEK293 assays”及“TREX ZDHHC20 proteomics”小节；Fig. 5图注
其他ZDHHC家族成员筛选	各ZDHHC突变体（ZDHHC3 I182G、ZDHHC7 L57G、ZDHHC11 M181A、ZDHHC15 Y184G）、探针浓度15 μM、处理时间4 h、n=3 阅读提示：Fig. 6及Extended Data Fig. 9图注；Methods中“ZDHHC structural modeling”小节

环节

核对要点

ZDHHC20化学遗传标记与底物鉴定

探针浓度15 μM、处理时间8 h、细胞系（HEK293T、MDA-MB-231、PANC1）、转染质粒量1–2 μg、统计标准（S0=0.5，FDR=0.01，n=4）

阅读提示：Methods中“Cellular ZDHHC-autoacylation and substrate transfer”及“On-bead hydrolysis proteomics”小节；Fig. 3b图注

体外酶动力学测定

ZDHHC20浓度20 nM、底物浓度范围、KDH用量2 μl、反应缓冲液组成、18-Bz-CoA背景速率扣除

阅读提示：Methods中“ZDHHC20 enzyme kinetic mutant and probe analysis”小节；Extended Data Fig. 2

S-酰化位点验证

突变位点（STX7 C28A/C239A、VAMP3 C76A、BCAP31 C23A、PTRH2 C28A）、探针浓度15 μM、处理时间4 h或24 h、n=3

阅读提示：Fig. 4及Extended Data Fig. 6g,h图注；Methods中“Mutagenesis”小节

诱导型低表达系统

多西环素浓度1 μg/ml、诱导时间24 h、探针浓度15 μM、处理时间8 h或24 h、n=4

阅读提示：Methods中“TREX HEK293 assays”及“TREX ZDHHC20 proteomics”小节；Fig. 5图注

其他ZDHHC家族成员筛选

各ZDHHC突变体（ZDHHC3 I182G、ZDHHC7 L57G、ZDHHC11 M181A、ZDHHC15 Y184G）、探针浓度15 μM、处理时间4 h、n=3

阅读提示：Fig. 6及Extended Data Fig. 9图注；Methods中“ZDHHC structural modeling”小节

大家都在搜

大家都在搜