iBE小鼠的构建与验证
建立可调控表达碱基编辑器的小鼠品系，并验证其表达调控特性。
将TRE-BE3RA转基因靶向Col1a1位点，通过ES细胞注射获得嵌合体小鼠，与CAGs-rtTA3小鼠杂交，得到iBEhem和iBEhom小鼠；使用多西环素饲料诱导，通过免疫印迹和免疫荧光检测BE表达，通过RNA-seq分析转录组变化。
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利用受调控的体内碱基编辑生成精准的临床前癌症模型
Generation of precision preclinical cancer models using regulated in vivo base editing.
实验完整度
高包含体外类器官、体内小鼠模型和原代细胞等多层级验证，并进行了功能获得/缺失和机制验证。
主要模型
iBE小鼠（CAGs-rtTA3;TRE-BE3RA） 小鼠小肠、胰腺和气管基底细胞类器官 皮下和肝脏移植瘤模型 肝细胞癌和胰腺导管腺癌原位模型
重点核对
多西环素给药剂量200 mg/kg饲料，处理1或2周 iBE小鼠基因型（iBEhem或iBEhom）影响编辑效率和均一性 类器官核转染使用合成sgRNA或质粒sgRNA，编辑效率通过靶向深度测序定量 肝内注射或胰腺电穿孔递送SB-Myc或SB-Kras与sgRNA，观察肿瘤形成 功能选择条件：RSPO撤除、Nutlin3、TGFβ、Selumetinib
摘要
尽管单核苷酸变异（SNVs）占癌症相关基因改变的多数，并且已被全面编目，但对其在肿瘤起始和进展中的影响知之甚少。为了对癌症相关SNVs进行功能研究，我们开发了一种用于时间性和可调控的体内碱基编辑（iBE）的小鼠系统。iBE小鼠携带一个受四环素响应元件（TRE）控制的表达优化的胞嘧啶碱基编辑器转基因，能够在体内广泛组织中实现稳健的多西环素依赖性表达。结合基于质粒的或合成的引导RNA，iBE能够在肠道、肺和胰腺类器官中高效地工程化单个或多个SNVs。BE活性的时间调控允许在离体和体内进行受控的连续基因组编辑，而将sgRNAs直接递送到靶组织有助于生成原位临床前癌症模型。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否建立一种可时空调控的体内碱基编辑系统，以高效生成携带特定癌症相关单核苷酸变异的精准临床前癌症模型？
- 核心机制
- 通过多西环素调控的TRE驱动表达优化胞嘧啶碱基编辑器BE3RA，在体内外实现可逆的C:G到T:A编辑，结合sgRNA递送在靶组织中引入特定SNVs，驱动肿瘤发生。
- 主要证据
- 在iBE小鼠多组织中验证多西环素依赖的BE表达和低脱靶编辑；在肠道、胰腺和肺类器官中实现高效单基因和多基因编辑；通过肝内注射和胰腺电穿孔在体内生成HCC和PDAC模型，并验证了编辑效率和肿瘤表型。
- 研究意义
- iBE平台能够快速、可调控地在多种组织中创建精确的SNVs，用于研究错义和无义突变在肿瘤起始和进展中的作用，并支持多重和序贯编辑，有助于模拟人类癌症的复杂遗传组合。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
脱靶编辑评估
评估iBE系统在RNA和DNA水平的脱靶编辑风险。
对多西环素处理的小鼠肝脏和肠道RNA进行RNA-seq分析C>U编辑；使用表达ApcQ1405和Pik3caE545K sgRNA的iBE ESCs，经过多西环素处理并克隆，对MSK-IMPACT panel进行超深度测序检测DNA脱靶。
类器官中的碱基编辑
验证iBE类器官中高效单基因和多基因编辑的可行性。
从小肠、胰腺和气管基底细胞建立iBE类器官，使用GFPGO报告基因或靶向深度测序定量编辑效率；通过核转染递送质粒或合成sgRNA，进行单基因或多基因编辑，并应用功能选择培养基富集突变细胞。
序贯碱基编辑验证（体外和体内）
验证iBE系统支持时间上分离的序贯编辑。
在体外先编辑四个基因（APSP）的类器官，撤除多西环素后转导GFPGO报告基因，再诱导编辑；将类器官移植到小鼠皮下或肝脏，待肿瘤形成后给予多西环素诱导GFPGO编辑，通过荧光成像和流式细胞术检测。
体内肝脏肿瘤模型的生成
利用iBE小鼠通过流体动力学尾静脉注射生成肝癌模型。
通过HTVI递送SB-Myc和靶向Apc、Ctnnb1或Trp53的sgRNA（质粒或合成），在多西环素处理的小鼠中诱导编辑，观察肿瘤形成，进行组织学和测序分析。
体内胰腺肿瘤模型的生成
利用iBE小鼠通过胰腺电穿孔生成胰腺导管腺癌模型。
通过电穿孔递送SB-KrasG12D和靶向Trp53或Pik3ca的sgRNA（质粒或合成），在多西环素处理的小鼠中诱导编辑，观察肿瘤形成，进行组织学和测序分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 多西环素饲料 | Envigo | TD.180625 |
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | Corning | 10-013-CV |
| 青霉素/链霉素 | Corning | 30-002-Cl | |
| 类器官培养 | 基质胶 | BD Biosciences | 354230 |
| Primocin | InvivoGen | -- | |
| Y-27632 | MedChemExpress | HY-10583 | |
| LDN-0193189 | Selleck Chemicals | -- | |
| CHIR99021 | -- | -- | |
| RSPO1条件培养基 | -- | -- | |
| 表皮生长因子 | Invitrogen | -- | |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒 | Sigma Aldrich | I3146 | |
| 霍乱毒素 | Sigma Aldrich | C9903 | |
| 牛垂体提取物 | Sigma Aldrich | P1476 | |
| 类器官核转染 | 原代P3缓冲液 | Lonza | V4XP-3032 |
| Supplement 1 | Lonza | V4XP-3032 | |
| 合成sgRNA | Synthego Corp. | -- | |
| Nucleofector X单元 | Lonza | -- | |
| 类器官功能选择 | Nutlin3 | -- | -- |
| 转化生长因子β1 | -- | -- | |
| 司美替尼 | -- | -- | |
| 肿瘤消化 | IV型胶原酶 | -- | -- |
| DNA酶 | -- | -- | |
| 流式细胞术 | 抗CD16/32抗体 | Biolegend | 101320 |
| CD4-PE抗体 | BD | 100408 | |
| CD8 PE-Cy7抗体 | BD | 100710 | |
| CD19 PE-Cy7抗体 | BD | 115509 | |
| CD11b PE抗体 | BD | 101207 | |
| GR1 PE抗体 | BD | 108407 | |
| CD45-APC抗体 | BD | 103112 | |
| Attune NxT流式细胞仪 | Thermo Fisher | -- | |
| 蛋白质印迹 | Cas9抗体 | Biolegend | 844301 |
| 肌动蛋白抗体 | Abcam | ab49900 | |
| 免疫荧光 | 兔抗Cas9抗体 | CST | 19526 |
| 鼠抗p53抗体 | CST | 2524 | |
| 鼠抗谷氨酰胺合成酶抗体 | BD Transduction Labs | 610517 | |
| 鼠抗β-连环蛋白抗体 | CST | 2698 | |
| 兔抗细胞角蛋白19抗体 | Abcam | ab133496 | |
| 兔抗α平滑肌肌动蛋白抗体 | Abcam | ab5694 | |
| 兔抗RFP抗体 | Rockland | AB_2209751 | |
| 鸡抗GFP抗体 | Abcam | ab13970 | |
| 兔抗磷酸化AKT抗体 | CST | 4060 | |
| 驴抗兔594二抗 | Invitrogen | A21207 | |
| 驴抗鼠647二抗 | Invitrogen | A31571 | |
| PCR扩增 | Herculase II Fusion DNA聚合酶 | Agilent Technologies | 600675 |
| PCR纯化 | QIAquick PCR纯化试剂盒 | Qiagen | 28106 |
| RNA提取 | Trizol | Invitrogen | 15596-026 |
| 重组DNA酶I | Roche Diagnostics | 04716728001 | |
| Qiagen RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | 74106 | |
| 肝内注射 | SB13转座酶 | -- | -- |
| SB-Myc质粒 | -- | -- | |
| 胰腺电穿孔 | NEPA21电转仪 | NEPAGENE | NEPA21 Type II |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| iBE小鼠诱导 | 多西环素给药剂量（200 mg/kg饲料）、给药时间（1或2周）、小鼠基因型（iBEhem或iBEhom） 阅读提示：Methods: Animals；Results: Tightly regulated in vivo expression of an optimized base editor |
| 类器官碱基编辑 | 多西环素浓度（500 ng/mL）、处理时间（核转染前2天和后2天）、sgRNA递送方式（核转染）和用量（200 pmol合成sgRNA或1 μg质粒）、功能选择条件 阅读提示：Methods: Organoid Nucleofection；Organoid functional selection；Figure 2 |
| 体内肝脏肿瘤模型 | HTVI注射质粒用量（1 μg SB13、5 μg SB-Myc、20 μg质粒sgRNA或2 nmol合成sgRNA）、多西环素处理时间（注射前1周和注射后1周）、肿瘤分析时间（注射后6周） 阅读提示：Methods: Hydrodynamic tail vein injections；Figure 4 |
| 体内胰腺肿瘤模型 | 胰腺电穿孔质粒用量（5 μg SB13、25 μg SB-KrasG12D、20 μg质粒sgRNA或2 nmol合成sgRNA）、多西环素处理时间（电穿孔前后共2周）、电穿孔参数 阅读提示：Methods: Pancreas electroporation；Figure 5 |
| 序贯编辑体内验证 | 移植肿瘤生长时间（皮下10天，肝内8周）、多西环素诱导时间（1周）、检测方法（IVIS成像和流式细胞术） 阅读提示：Methods: Tumor implantation；Figure 3 |