EMcapsulin设计与表达
构建固定稳定、重金属相互作用的同心EM条形码
将金属硫蛋白（M）融合到 encapsulin 单体N端，在不同大小封装蛋白（Qt, Mx, Tm）腔内表达1-3个M拷贝，形成六类EMcapsulin。
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用于相关体积电子显微镜的基因编码条形码
Genetically encoded barcodes for correlative volume electron microscopy.
实验完整度
高包含HEK293T细胞体外模型、果蝇和小鼠在体模型，以及自动分割和功能验证。
主要模型
HEK293T细胞 果蝇神经元 小鼠海马神经元 哺乳动物卵母细胞
重点核对
EMcapsulin六类在TEM下的自动分割与分类（Dice系数验证集0.65，测试集1为0.71，测试集2为0.63） 果蝇神经元中1M-QtFLAG-NLS和1M-MxFLAG-NLS的表达与TEM对比验证 小鼠海马AAV转导2M-QtFLAG与mScarlet-I共表达及免疫组化验证 荧光EMcapsulin与mCherry标记的亚细胞结构共定位（Manders系数M1 0.870, M2 0.966） SasG连接子长度对EMcapsulin模式间距的影响（n=30，误差棒±s.d.）
摘要
尽管基因编码报告基因在荧光显微镜中很常见，但用于电子显微镜（EM）的等效多重基因报告基因仍然稀少。在此，通过在不同大小的封装蛋白纳米隔室腔内安装数量可变的固定稳定金属相互作用部分，我们开发了一套球对称且同心的条形码（EMcapsulins），可通过标准EM技术读取。六类EMcapsulins可以被自动分割和区分。通过使用一组长度可变的刚性间隔物将几个EMcapsulins排列成不同模式，编码容量进一步增加。表达荧光EMcapsulins以在光学和EM中监测亚细胞结构。在果蝇和小鼠大脑中的神经元表达使得能够在EM中自动识别基因定义的细胞。EMcapsulins与透射EM、扫描EM和聚焦离子束扫描EM兼容。可扩展的基因控制EM可读条形码调色板可以用多重基因表达图谱增强解剖EM图像。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否开发出基因编码、固定稳定且可多重读取的电子显微镜对比剂，以在标准EM流程中实现基因表达的多重映射？
- 核心机制
- 通过在 encapsulin 纳米隔室腔内融合金属硫蛋白（M）的拷贝数及使用不同大小封装蛋白壳，形成同心环状EM对比；通过刚性间隔物排列多个EMcapsulin形成图案，增加编码容量。
- 主要证据
- 在HEK293T细胞中表达六类EMcapsulin并通过TEM自动分割区分；在果蝇神经元和小鼠脑内表达并自动识别；荧光EMcapsulin靶向亚细胞结构并在光镜和电镜下验证。
- 研究意义
- EMcapsulin可作为多通道EM报告基因工具，将多重基因表达信息叠加到解剖EM图像上，适用于体积EM和连接组学。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
EMcapsulin的TEM对比与自动分割
验证EMcapsulin在标准EM下的对比度并测试自动分类可行性
对表达不同EMcapsulin的HEK293T细胞进行TEM成像，训练U-net进行多类语义分割，评估六类EMcapsulin的区分度。
EMcapsulin图案化
通过刚性间隔物排列多个EMcapsulin，增加编码容量
构建SasG刚性连接子（2-10G），连接sfGFP和mCherry，与表面修饰抗体的EMcapsulin共表达，观察TEM下图案形成。
荧光EMcapsulin靶向亚细胞结构
实现光镜和电镜关联分析
将eUnaG融合到EMcapsulin，通过抗mCherry内抗体靶向膜定位mCherry，或通过翻译通读系统调节抗体比例靶向Cx43。
果蝇神经元在体表达与EM检测
验证EMcapsulin在神经元中的表达和EM对比
生成转基因果蝇品系，在神经元中表达1M-QtFLAG-NLS和1M-MxFLAG-NLS，进行荧光和TEM分析。
小鼠海马在体表达与EM检测
评估EMcapsulin在哺乳动物神经元中的对比
通过AAV5-CaMKIIa-mScarlet-I-P2A-2M-QtFLAG注射到小鼠海马，1个月后进行荧光和TEM分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Advanced Dulbecco改良Eagle培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 细胞转染 | X-tremeGENE HP转染试剂 | Roche | -- |
| EM样品制备 | 醋酸铀 | Electron Microscopy Sciences | -- |
| 天冬氨酸铅 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 单宁酸 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 2-十二烯基琥珀酸酐 | Serva | -- | |
| 甲基纳迪克酸酐 | Serva | -- | |
| 甘油醚100 | Serva | -- | |
| 环氧丙烷 | Electron Microscopy Sciences | -- | |
| 环氧树脂 | Electron Microscopy Sciences | -- | |
| 免疫荧光 | 大鼠抗FLAG抗体 | Novus Biologicals | NBP-1-06712 |
| 兔抗Sox102F抗体 | -- | -- | |
| 小鼠抗Bruchpilot抗体 | Developmental Studies Hybridoma Bank | AB2314866 | |
| Alexa Fluor 568标记的山羊抗小鼠抗体 | Invitrogen | A11004 | |
| Alexa Fluor 568标记的山羊抗兔抗体 | Invitrogen | A-11011 | |
| Alexa Fluor 647标记的山羊抗大鼠抗体 | Invitrogen | A21247 | |
| DAPI | Invitrogen | -- | |
| 小鼠脑免疫组化 | 抗FLAG FITC抗体 | Sigma-Aldrich | F4049 |
| DAPI | -- | -- | |
| 活细胞成像 | 胆红素 | Sigma-Aldrich | -- |
| 二丁酰环腺苷酸 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 凝胶电泳 | NativePAGE Novex Bis-Tris凝胶系统 | Invitrogen | -- |
| SilverQuest银染试剂盒 | Invitrogen | LC6070 | |
| 下拉实验 | 抗FLAG M2磁珠 | Sigma-Aldrich | M8823 |
| 3×FLAG肽 | Sigma-Aldrich | F4799 | |
| Spot-Trap磁性琼脂糖珠 | ChromoTek | etma | |
| 凝胶电泳 | SIGMAFAST DAB试剂盒 | Sigma-Aldrich | D0426 |
| 小鼠手术 | 2%利多卡因 | Braun | -- |
| 美洛昔康 | Metacam 2 mg/ml, Boehringer Ingelheim | -- | |
| 组织消化 | 哺乳动物蛋白提取试剂 | Thermo Scientific | 78501 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| EMcapsulin在HEK293T细胞中的表达 | 转染试剂X-tremeGENE HP用量（3μl试剂/μg DNA）、细胞融合度、表达时间（36小时） 阅读提示：Methods中Mammalian cell culture小节 |
| EM样品制备 | 固定时间（HEK细胞20分钟，果蝇脑20分钟至24小时）、OsO4后固定时间（20分钟）、醋酸铀染色时间（30分钟）、柠檬酸铅染色时间（15分钟） 阅读提示：Methods中EM sample preparation小节 |
| TEM成像 | 加速电压120kV、放大倍数（像素尺寸1.81nm）、曝光时间1000ms 阅读提示：Methods中TEM小节 |
| 小鼠海马AAV注射 | 注射体积1μl、病毒滴度~1×10^12颗粒、注射深度1500μm、注射速度（10分钟）、小鼠品系（C57BL/6N，3月龄雄性） 阅读提示：Methods中Viral injections小节 |
| 荧光EMcapsulin靶向亚细胞结构 | 1M-Qtanti-mCherry与1M-QteUnaG共表达比例4:1、eUnaG-1M-Qtanti-mCherry mRNA注射浓度（112或224 ng/μl） 阅读提示：Methods中Fluorescence microscopy on HEK cells和Live-cell microscopy on mammalian oocytes小节 |