二肽重复蛋白抑制C9ORF72 ALS/FTD中的同源定向DNA双链断裂修复

背景：C9ORF72六核苷酸重复扩增是肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶痴呆（FTD）最常见的已知遗传原因，这两种疾病都是致命的年龄相关性神经退行性疾病。C9ORF72扩增编码五种二肽重复蛋白（DPR），这些蛋白通过一种非经典翻译机制产生。在DPR中，脯氨酸-精氨酸（PR）、甘氨酸-精氨酸（GR）和甘氨酸-丙氨酸（GA）的神经毒性最强，并增加DNA双链断裂（DSB）的频率。虽然这些基因毒性损伤的积累日益被认为是疾病的一个特征，但DPR介导的DNA损伤的机制尚不清楚，且DPR对每种DNA DSB修复途径效率的影响此前尚未被评估。方法与结果：使用DNA DSB修复试验，我们评估了特定修复途径的效率，发现PR、GR和GA降低了非同源末端连接（NHEJ）、单链退火（SSA）和微同源介导的末端连接（MMEJ）的效率，但不影响同源重组（HR）。我们发现PR部分通过结合核仁蛋白核磷蛋白（NPM1）来抑制DNA DSB修复。NPM1的耗竭抑制了NHEJ和SSA，表明PR表达细胞中NPM1的功能丧失导致非同源和同源定向DNA DSB修复途径均受阻。通过删除NPM1的亚细胞定位信号，我们发现PR结合NPM1，无论NPM1被导向哪个细胞区室。删除已知与其他富含精氨酸蛋白结合的NPM1酸性环基序，消除了PR与NPM1的结合。使用共聚焦和超分辨免疫荧光显微镜，我们发现RAD52（SSA修复机制的组成部分）的水平在iPSC神经元中相对于通过CRISPR/Cas9基因组编辑删除了C9ORF72扩增的等基因对照显著增加。死后脑组织的Western分析证实，与对照组相比，C9ALS/FTD样本中RAD52免疫反应性显著增加。结论：总的来说，我们表征了DPR对关键DNA DSB修复途径的抑制作用，确定了NPM1是DNA修复的促进因子，而PR抑制该因子，并揭示了同源定向DNA DSB修复途径的缺陷是C9ORF72相关疾病的一个新特征。