小鼠免疫与体液免疫应答检测
评估BNT162b2诱导的抗体和生发中心反应
C57BL/6小鼠第0天和第21天肌内注射5 μg BNT162b2，检测抗S IgG、IgG1、IgG2c结合抗体、假型慢病毒中和抗体（针对WT及Alpha、Beta、Gamma、Delta、Epsilon变异株），流式检测dLN中GC B细胞、TFH细胞和浆细胞。
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对Pfizer-BioNTech BNT162b2疫苗的先天性和适应性免疫机制
Mechanisms of innate and adaptive immunity to the Pfizer-BioNTech BNT162b2 vaccine.
实验完整度
高使用多种基因敲除小鼠、单细胞转录组、流式细胞术及体内中和/清除实验，涵盖先天与适应性免疫及机制验证
主要模型
C57BL/6小鼠 Mda5−/−、Ifnar1−/−等基因敲除小鼠 dLN及肺、脾组织样本 HEK293T细胞及ACE2/TMPRSS2/HeLa细胞
重点核对
BNT162b2剂量5 μg/只或0.2 μg/只，肌内注射50 μL，初次免疫第0天、加强第21天 Mda5−/−与Ifnar1−/−小鼠中CD8 T细胞应答和IFNα水平 抗IFNγ受体中和抗体1 mg/只于第19、20、21天腹腔注射 CD4/CD8或NK细胞清除抗体0.3 mg/只于第20天腹腔注射 scRNAseq中dLN细胞按CD11b+髓系、pDC、DC富集后1:1混合
摘要
尽管BNT162b2 mRNA疫苗取得了成功，但其发挥效力的免疫学机制仍知之甚少。本研究分析了小鼠对BNT162b2的先天性和适应性免疫应答，发现免疫接种可激发强效的抗体和抗原特异性T细胞应答，并在二次免疫后显著增强先天免疫应答，同时二次免疫后一天血清IFNγ水平升高。值得注意的是，我们发现dLNs中的自然杀伤细胞和CD8 T细胞是循环IFNγ的主要产生者。对基因敲除小鼠的分析显示，BNT162b2诱导抗体和T细胞应答不依赖于TLR2、3、4、5、7的信号传导，也不依赖于炎症小体激活，以及坏死性凋亡或焦亡细胞死亡途径。相反，BNT162b2诱导的CD8 T细胞应答依赖于I型IFN依赖的MDA5信号。这些结果揭示了BNT162b2疫苗刺激免疫应答的分子机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- BNT162b2 mRNA疫苗诱导先天性和适应性免疫应答的分子机制，特别是宿主先天免疫系统如何识别该疫苗并调控适应性免疫。
- 核心机制
- BNT162b2通过MDA5感知诱导I型IFN（IFNα）产生，IFNα通过IFNAR1信号促进抗原特异性CD8 T细胞克隆扩增；二次免疫后CD4和CD8 T细胞产生大量IFNγ，增强髓系细胞活化。
- 主要证据
- 小鼠免疫后抗体和T细胞应答强效；Mda5−/−小鼠CD8 T细胞应答和IFNα显著降低，Ifnar1−/−小鼠CD8 T细胞应答显著减少；Tlr2/3/4/5/7−/−、Asc−/−、Nlrp3−/−、cGas−/−、Sting−/−、Ripk3−/−、Gsdmd−/−小鼠抗体和T细胞应答未受损；抗IFNγ受体抗体降低单核细胞ISG表达和 innate细胞活化；scRNAseq显示S mRNA主要位于单核/巨噬细胞和迁移性DC。
- 研究意义
- 研究提供了BNT162b2在体内作用机制的见解，有助于更好理解该疫苗并指导未来改进疫苗的设计。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
T细胞应答检测
评估BNT162b2诱导的抗原特异性CD4和CD8 T细胞应答及组织驻留记忆T细胞
在第21和42天取脾和肺，用MHC-I四聚体检测抗原特异性CD8 T细胞，用重叠肽池刺激后胞内细胞因子染色检测IFNγ、TNF、IL-2、IL-4，并检测肺TRM（CD3+CD8+CD44+CD69+CD103+）。
先天免疫应答及细胞因子检测
分析dLN和其他组织中先天免疫细胞活化及血清细胞因子动态
流式检测dLN、非dLN、肺、脾中单核细胞、巨噬细胞、pDC、DC亚群的频率和CD86表达；Luminex检测血清细胞因子/趋化因子（MCP1、MIP1b、IL-6、CXCL10、IFNγ等）；ELISA检测IFNα。
单细胞转录组分析先天免疫应答
在单细胞水平解析dLN免疫细胞对BNT162b2的转录反应，并与YF-17D比较
免疫后第1、3、7天取dLN，采用“enrich-mix”策略富集CD11b+髓系、pDC和DC后与总细胞1:1混合，10x Chromium 3’ V3建库测序，分析DEG、BTM富集及髓系亚群重嵌入。
二次免疫后增强的先天免疫应答及IFNγ来源与功能验证
验证二次免疫后先天免疫增强是否由IFNγ介导，并确定IFNγ细胞来源
检测初免和加强后6 h血清IFNγ；流式检测dLN中产生IFNγ的细胞类型；用抗IFNγ受体中和抗体（1 mg/只，第19、20、21天腹腔注射）阻断后检测单核细胞ISG和AP-1表达及 innate细胞活化；用抗CD4/CD8或NK1.1清除抗体（0.3 mg/只，第20天腹腔注射）后检测血清IFNγ和 innate细胞活化。
疫苗mRNA和S蛋白在体内的分布检测
明确BNT162b2 mRNA在dLN中的摄取细胞类型及组织分布，并检测血清S蛋白
利用scRNAseq数据检测S mRNA reads分布；RT-PCR检测各组织S mRNA浓度；ELISA检测血清S蛋白。
先天感知通路及CD8 T细胞机制验证
鉴定BNT162b2的先天感知受体及调控CD8 T细胞应答的信号轴
免疫Tlr2−/−、Tlr3−/−、Tlr4−/−、Tlr5−/−、Tlr7−/−、Asc−/−、Nlrp3−/−、cGas−/−、Sting−/−、Ripk3−/−、Gsdmd−/−、Mda5−/−、Ifnar1−/−、Batf3−/−小鼠，检测抗体和T细胞应答；ELISA检测Mda5−/−和Ifnar1−/−小鼠血清IFNα；流式检测 innate细胞活化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织消化 | IV型胶原酶 | Worthington | -- |
| 流式分析 | Zombie UV活性染料 | BioLegend | 423107 |
| 抗Ly6C抗体 | BioLegend | 128041 | |
| 抗CD86抗体 | BioLegend | 105020 | |
| 抗CD11b抗体 | BioLegend | 101239 | |
| 抗CD11c抗体 | BioLegend | 117330 | |
| 抗PDCA-1抗体 | BD | 749275 | |
| 抗F4/80抗体 | BD | 749283 | |
| 抗CD3抗体 | BioLegend | -- | |
| 抗CD4抗体 | BioLegend | -- | |
| 抗CD8α抗体 | BioLegend | -- | |
| 抗IFNγ抗体 | BioLegend | -- | |
| Spike S特异性四聚体 | NIH tetramer core facility | -- | |
| 体内阻断 | 抗IFNγ受体中和抗体 | Bioxcell | BE0287 |
| 同型对照IgG | Bioxcell | BE0091 | |
| 细胞清除 | 抗小鼠CD8抗体 | Bioxcell | BE0117 |
| 抗小鼠CD4抗体 | Bioxcell | BE0003-1 | |
| 抗小鼠NK1.1抗体 | Bioxcell | BE0036 | |
| Luminex检测 | 小鼠48重Procarta试剂盒 | Thermo Fisher | EPX480-20834-901 |
| ELISA | SARS-CoV-2 Spike蛋白 | Sino Biologicals | 40589-V08B1 |
| HRP标记山羊抗小鼠IgG | SouthernBiotech | -- | |
| 假型慢病毒生产 | Bio T转染试剂 | -- | -- |
| S蛋白检测 | SARS-CoV-2 Spike检测ELISA试剂盒 | Sino Biological | KIT40591 |
| RT-PCR | PureLink RNA小量提取试剂盒 | Invitrogen | -- |
| Luna通用探针一步法RT-PCR试剂盒 | NEB | -- | |
| ELISA | Quantikine ELISA试剂盒 | R&D Systems | MIF00 |
| ELISA试剂盒 | PBL | 421201 | |
| 化学发光ELISA试剂盒 | Novus Biologicals | NBP262782 | |
| dsDNA检测 | Quant-iT PicoGreen dsDNA检测试剂盒 | Invitrogen | P11496 |
| 尿酸检测 | 尿酸检测试剂盒 | abcam | ab65344 |
| scRNAseq | 10x Chromium 3’ V3化学系统 | 10x Genomics | -- |
| C1000 touch PCR仪 | Bio-Rad | -- | |
| SPRI磁珠 | Beckman | B23318 | |
| HiSeq 4000测序仪 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠免疫 | BNT162b2剂量（5 μg/只或0.2 μg/只）、注射体积（50 μL）、肌内注射部位、初免和加强时间（第0天和第21天） 阅读提示：Methods and Reagents Details中“Mice and immunization”小节；Fig. 1a时间线 |
| 抗体和T细胞应答检测 | 检测时间点（第14、21、42天）、组织（血清、脾、肺、dLN）、样本量（每组n=6–16）、肽池刺激浓度（1 μg/mL/肽） 阅读提示：Fig. 1b–f、Fig. 2a–d图注；Methods中“Intracellular cytokine staining assay”和“Antigen-specific tetramer and tissue-resident memory T cell staining” |
| 先天免疫细胞活化检测 | 检测时间点（6 h、1天、3天、7天）、组织（dLN、非dLN、肺、脾）、CD86作为活化标志、流式抗体克隆和稀释比例 阅读提示：Fig. 3a–d图注；Methods中“Flow cytometry analysis of innate cells” |
| 二次免疫后IFNγ功能验证 | 抗IFNγ受体抗体剂量（1 mg/只）、给药时间（第19、20、21天）、给药途径（腹腔注射）、对照（同型IgG）、检测终点（第22天） 阅读提示：Fig. 5f–h图注；Methods中“Flow cytometry of IFNγ-producing cells in lymph nodes” |
| MDA5-IFNAR1机制验证 | 基因敲除小鼠品系背景（Mda5−/−、Ifnar1−/−为C57BL/6背景）、年龄（8–14周）、性别匹配、免疫方案同前、检测时间点（第42天抗体和T细胞，第6 h血清IFNα） 阅读提示：Fig. 7a–l图注；Methods中“Mice and immunization” |
| scRNAseq样本制备 | 富集细胞类型（CD11b+髓系、pDC、DC）、富集后与总细胞比例（1:1）、测序平台和深度、质控标准（线粒体RNA<20%、unique features≥100、总reads≥200） 阅读提示：Methods中“scRNAseq samples and preparation”和“sc-RNAseq data analysis”；Fig. 4a |