ASM活性检测与iNKT细胞数量分析
确定ASM在免疫组织中的活性及其缺陷对iNKT细胞的影响。
检测野生型小鼠各组织ASM活性；流式细胞术分析Asm−/−和野生型小鼠胸腺、脾、肝脏中iNKT细胞比例和绝对数。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
鞘磷脂调控CD1d限制性抗原呈递与炎症
Control of CD1d-restricted antigen presentation and inflammation by sphingomyelin.
实验完整度
高包含体外细胞实验、小鼠模型、患者样本、脂质组学、晶体结构等多层级证据，并进行了功能与机制验证。
主要模型
Asm−/−小鼠（C57BL/6背景） 野生型C57BL/6小鼠及骨髓嵌合体 Niemann-Pick病患者（NPD-A和NPD-B）及健康对照 EBV转化的B细胞和NKT杂交瘤细胞系
重点核对
Asm−/−小鼠与野生型小鼠年龄和性别匹配 CD1d限制性抗原呈递通过iNKT杂交瘤IL-2释放检测 rhASM剂量5 μg g−1，每两天一次，从出生后第2天至2周龄 α-GalCer剂量2 μg腹腔注射，检测4小时和24小时血清细胞因子和ALT ConA剂量13.5 mg kg−1尾静脉注射，仅雄性小鼠，检测6小时和24小时血清指标
摘要
恒定自然杀伤T（iNKT）细胞识别CD1d呈递的激活性和微生物脂质。CD1d也可结合非激活性脂质，如鞘磷脂。我们假设这些脂质作为内源性调节因子，并研究了酸性鞘磷脂酶（ASM）缺陷的人类和小鼠，ASM是降解鞘磷脂的酶。我们发现，小鼠中ASM缺失导致CD1d限制性抗原呈递减弱和胸腺中iNKT细胞选择减少，从而降低iNKT细胞水平并对iNKT细胞介导的炎症条件产生抗性。在ASM缺陷的Niemann-Pick病患者中也观察到抗原呈递缺陷和iNKT细胞减少，并且健康人中的ASM活性与iNKT细胞表型相关。药理学ASM给药促进抗原呈递并恢复ASM缺陷小鼠中的iNKT细胞水平。总之，这些结果表明，对非激动性CD1d相关脂质的控制对于体内iNKT细胞发育和功能至关重要，并代表了细胞鞘脂代谢与免疫之间的紧密联系。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 非激活性CD1d相关脂质（如鞘磷脂）是否作为内源性调节因子控制iNKT细胞发育和功能？
- 核心机制
- ASM通过降解鞘磷脂控制其水平，防止鞘磷脂竞争性抑制激动性脂质与CD1d结合，从而维持CD1d限制性抗原呈递和iNKT细胞选择与活化。
- 主要证据
- Asm−/−小鼠胸腺细胞和DC抗原呈递减少，iNKT细胞减少；rhASM治疗恢复iNKT细胞；NPD患者iNKT细胞减少；体外实验显示鞘磷脂竞争CD1d结合；CD1d-鞘磷脂晶体结构。
- 研究意义
- 揭示了细胞鞘脂代谢与免疫的紧密联系，提示ASM可能作为iNKT细胞相关免疫调节的靶点，并可能对NPD及常见免疫代谢疾病有启示。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
iNKT细胞依赖性疾病模型
验证ASM缺陷对体内iNKT细胞介导炎症的影响。
使用α-GalCer肝炎、噁唑酮诱导的迟发型超敏反应和ConA肝炎模型，检测血清ALT、细胞因子和病理变化。
CD1d限制性抗原呈递检测
评估ASM缺陷对胸腺细胞和DC抗原呈递能力的影响。
分离胸腺细胞和CD11c+ DC，与iNKT杂交瘤共培养，检测IL-2释放；使用抗CD1d抗体19G11阻断验证CD1d依赖性。
骨髓嵌合体实验
确定ASM缺陷导致的iNKT细胞减少是细胞内在性还是抗原呈递细胞依赖性。
建立混合骨髓嵌合体和野生型骨髓重建Asm−/−小鼠，3个月后流式检测iNKT细胞。
脂质组学分析
检测ASM缺陷对胸腺和肝脏鞘脂组成的影响。
质谱分析2周龄野生型和Asm−/−小鼠胸腺和肝脏鞘磷脂和神经酰胺水平；分离胸腺细胞溶酶体进行脂质组学。
体外脂质竞争实验
验证鞘磷脂是否竞争性抑制激动性脂质与CD1d结合。
板结合CD1d与α-GalCer及不同鞘磷脂物种共孵育，加入DN32.D3杂交瘤检测IL-2；IEF凝胶分析脂质交换。
CD1d-鞘磷脂晶体结构解析
从结构角度阐明鞘磷脂与CD1d的结合模式。
重组小鼠CD1d负载鞘磷脂C24:1，结晶并解析结构至1.95 Å。
rhASM酶替代治疗
测试药理学ASM给药能否恢复iNKT细胞水平和抗原呈递。
Asm−/−和野生型小鼠接受rhASM注射，检测DC抗原呈递能力和iNKT细胞水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 流式细胞术 | 抗小鼠CD16/32抗体（克隆93） | BioLegend | 101302 |
| 抗小鼠CD3e抗体（克隆145-2C11） | BD Biosciences | 553066 | |
| 抗小鼠TCRβ抗体（克隆H57-597） | BD Biosciences | 553170 | |
| 抗小鼠TCRβ抗体（克隆H57-597） | BioLegend | 109212 | |
| 抗小鼠CD45.1抗体（克隆A20） | BioLegend | 110728 | |
| 抗小鼠CD45.2抗体（克隆104） | BD Biosciences | 553772 | |
| 抗小鼠CD1d抗体（克隆1B1） | BD Biosciences | 553846 | |
| 抗小鼠CD11c抗体（克隆HL3） | BD Biosciences | 553801 | |
| 抗小鼠CD44抗体（克隆1M7） | BioLegend | 103031 | |
| 抗小鼠CD24抗体（克隆M1/69） | BioLegend | 101821 | |
| 抗小鼠NK1.1抗体（克隆PK136） | BioLegend | 108724 | |
| 抗小鼠CD4抗体（克隆RM4-5） | BioLegend | 100528 | |
| 抗小鼠CD8抗体（克隆53-6.7） | BioLegend | 100714 | |
| 抗小鼠TCR γ-δ抗体（克隆UC7-13DS） | BioLegend | 107504 | |
| 抗小鼠CD304抗体（克隆3E12） | BioLegend | 145207 | |
| 抗小鼠CD1d-α-GalCer复合物抗体（克隆L363） | eBioscience | 12-2019-82 | |
| 抗人CD1d抗体（克隆51.1） | BioLegend | 350308 | |
| 抗人CD3抗体（克隆UCHT1） | eBioscience | 17-0038-42 | |
| 抗人CD3抗体（克隆SK7） | eBioscience | 45-0036-42 | |
| 抗人CD4抗体（克隆RPA-T4） | eBioscience | 25-0049-42 | |
| 抗人CD8抗体（克隆RPA-T8） | eBioscience | 47-0088-42 | |
| 抗人CD161抗体（克隆HP-3G10） | eBioscience | 53-1619-42 | |
| CountBright绝对计数微球 | Molecular Probes | -- | |
| 细胞培养 | 抗生素-抗真菌剂 | Gibco | -- |
| 溶酶体分离 | 抗Lamp1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8098 |
| Protein G微珠 | Miltenyi Biotec | 130-071-101 | |
| Western blot | 抗Lamp1抗体 | Southern Biotech | 9835-01 |
| 抗Lamp2抗体 | Southern Biotech | 9840-01 | |
| 抗CoxIV抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-292052 | |
| 抗组蛋白H3抗体 | Cell Signaling | 4499S | |
| 抗Rab5抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-598 | |
| 抗组织蛋白酶D抗体 | Millipore | Ab2, IM16 | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | HRP-60004 | |
| 抗微管蛋白抗体 | Proteintech | HRP-66031 | |
| 细胞基抗原呈递实验 | CD1d单克隆抗体19G11 | BioXCell | BE0000 |
| 同型对照（克隆LTF-2） | BioXCell | BE0090 | |
| 脂质组学 | 内标混合物 | Avanti Polar Lipids | LM-6005 |
| 脂质竞争实验 | 硫脂 | Avanti Polar Lipids | -- |
| 鞘磷脂C24:1 | Avanti Polar Lipids | -- | |
| ASM活性检测 | ASM活性检测试剂盒 | Echelon Biosciences | -- |
| ELISA | 酶联免疫吸附实验 | BD Biosciences | -- |
| ALT检测 | 比色法 | Stanbio | -- |
| ConA肝炎模型 | 刀豆蛋白A | Sigma-Aldrich | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型与分组 | Asm−/−小鼠背景（C57BL/6，>10代回交），年龄和性别匹配，成年鼠>6周龄 阅读提示：Methods 'Mouse models'小节 |
| α-GalCer肝炎模型 | α-GalCer剂量2 μg，腹腔注射，检测时间4小时和24小时，血清IL-4、IFN-γ和ALT 阅读提示：Methods 'α-GalCer hepatitis'小节及Fig. 2a图注 |
| ConA肝炎模型 | ConA剂量13.5 mg kg−1，尾静脉注射，仅雄性小鼠，检测6小时和24小时 阅读提示：Methods 'Concanavalin A hepatitis'小节及Fig. 2f图注 |
| 抗原呈递实验 | 细胞数量（DC 50,000/孔，胸腺细胞100,000/孔），α-GalCer浓度100 ng ml−1，负载时间4小时，杂交瘤数量50,000-100,000/孔 阅读提示：Methods 'Cell-based antigen-presentation assays'小节 |
| rhASM治疗 | 剂量5 μg g−1，每两天一次腹腔注射，从出生后第2天至2周龄 阅读提示：Methods 'Enzyme replacement therapy'小节及Fig. 8图注 |
| 患者样本分析 | NPD患者（n=5）和健康对照（n=70）的外周血PBMC，流式抗体组合 阅读提示：Methods 'Patients with Niemann-Pick disease and healthy controls'小节 |