生物信息学预测NLR与TRAF相互作用
预测NLRC3与TRAF6的结合基序及NLR家族中TRAF结合基序的普遍性。
搜索NLRC3序列中的TRAF2结合基序，并比较不同物种间的保守性；检索其他NLR蛋白序列中的TRAF结合基序。
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先天免疫传感器NLRC3通过修饰信号转接头TRAF6和转录因子NF-κB减弱Toll样受体信号传导
The innate immune sensor NLRC3 attenuates Toll-like receptor signaling via modification of the signaling adaptor TRAF6 and transcription factor NF-κB.
实验完整度
高包含HEK293T过表达、THP-1稳定株、Nlrc3−/−小鼠原代巨噬细胞及内毒素休克模型，并有泛素化、共免疫沉淀等机制验证
主要模型
HEK293T细胞系 THP-1细胞系 Nlrc3−/−小鼠及野生型小鼠 小鼠腹腔和骨髓来源巨噬细胞
重点核对
HEK293T细胞转染NF-κB荧光素酶报告基因及递增剂量的NLRC3，24小时后检测荧光素酶活性 THP-1细胞稳定过表达Flag-NLRC3或敲低NLRC3，LPS刺激后检测TNF和IL6 mRNA及蛋白 Nlrc3−/−小鼠腹腔巨噬细胞LPS刺激1小时后检测Tnf、Il6、Il1b、Il12 mRNA Nlrc3−/−骨髓来源巨噬细胞LPS刺激后免疫沉淀内源TRAF6并检测K63连接泛素化 Nlrc3−/−小鼠腹腔注射LPS 4.5 mg/kg，监测体温和体重10天，24/48小时检测血清和腹腔细胞因子
摘要
NLR家族传感器中的几个成员激活先天免疫。相反，我们发现NLRC3通过与被TLR信号转接头TRAF6相互作用，减弱TRAF6的Lys63（K63）连接泛素化和NF-κB的激活，从而抑制Toll样受体（TLR）依赖的转录因子NF-κB激活。我们使用生物信息学预测NLR与TRAF蛋白之间的相互作用，包括TRAF与NLRC3的相互作用。在体内，给予脂多糖（LPS）后巨噬细胞Nlrc3 mRNA表达减少，但当细胞活化消退后恢复。为了评估生物学相关性，我们构建了Nlrc3−/−小鼠。LPS处理的Nlrc3−/−巨噬细胞具有更多的K63泛素化TRAF6、核NF-κB和促炎细胞因子。最后，LPS处理的Nlrc3−/−小鼠表现出更多的炎症迹象。因此，通过NLRC3和TLR的信号传导构成一个负反馈环路。此外，普遍存在的NLR-TRAF相互作用提示形成一种“TRAFasome”复合物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- NLRC3是否以及如何负向调控TLR诱导的NF-κB信号和炎症反应。
- 核心机制
- NLRC3通过其NBD中的TRAF结合基序与TRAF6结合，减弱TRAF6的K63连接泛素化，从而抑制NF-κB活化和核转位；TLR信号下调Nlrc3表达，构成负反馈环路。
- 主要证据
- HEK293T过表达和THP-1稳定株中NLRC3剂量依赖性抑制MyD88/TRAF6诱导的NF-κB报告基因活性，降低LPS诱导的TNF和IL6表达；Nlrc3−/−巨噬细胞中TRAF6 K63泛素化增加、p65核转位和磷酸化增强；Nlrc3−/−小鼠内毒素休克模型中体温和体重恢复延迟，血清和腹腔IL-6、TNF升高。
- 研究意义
- NLRC3作为TLR诱导炎症的检查点，防止炎症反应失调；NLR-TRAF相互作用可能形成‘TRAFasome’复合物，为靶向单个分子而不干扰全部过程提供理论基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
NLRC3对NF-κB报告基因活性的剂量依赖性抑制
确定NLRC3能否抑制MyD88/TRAF6依赖的NF-κB活化，并定位作用节点。
HEK293T细胞共转染NF-κB荧光素酶报告基因、激活蛋白（MyD88、IRAK、TRAF6、IKKα或p65）及递增剂量的NLRC3，24小时后检测荧光素酶活性。
NLRC3过表达或敲低对THP-1细胞LPS反应的影响
验证NLRC3在人类单核细胞系中对TLR信号的功能影响。
构建稳定过表达Flag-NLRC3或表达shNLRC3的THP-1细胞，LPS刺激后检测TNF和IL6 mRNA及蛋白分泌，并免疫印迹检测IκBα磷酸化。
NLRC3与TRAF6的相互作用及结合位点鉴定
验证NLRC3是否通过TRAF结合基序与TRAF6直接结合。
HEK293T细胞瞬转V5-TRAF6和HA-NLRC3，用抗V5琼脂糖免疫沉淀，免疫印迹检测HA；并构建TRAF结合位点1或2突变为丙氨酸的NLRC3突变体，检测与TRAF6的结合能力。
NLRC3对TRAF6蛋白稳定性和泛素化的影响
探究NLRC3是否影响TRAF6的降解及K48/K63连接泛素化。
HEK293T细胞转染V5-TRAF6和递增剂量HA-NLRC3，检测TRAF6蛋白量；转染TRAF6、HA-Ub（总泛素、K48或K63）及Flag-NLRC3，1% SDS裂解煮沸后免疫沉淀TRAF6，免疫印迹检测泛素。
Nlrc3−/−小鼠的构建与验证
获得NLRC3功能缺失小鼠以研究其生理作用。
通过同源重组用新霉素抗性基因替换Nlrc3外显子3（NBD编码区），在129S6/Sv胚胎干细胞中打靶，注射C57BL/6囊胚，嵌合体与C57BL/6回交九代获得F9 Nlrc3−/−小鼠；PCR和Southern blot验证基因型，RT-PCR验证表达缺失。
Nlrc3−/−巨噬细胞的促炎细胞因子和TRAF6分析
验证NLRC3缺失对巨噬细胞TLR反应及TRAF6蛋白量的影响。
分离野生型和Nlrc3−/−小鼠腹腔巨噬细胞，LPS刺激1小时后检测Tnf、Il6、Il1b、Il12、Ifnb、Tlr4、Traf6、Cyld、A20和Nfkbia mRNA；用TLR2、TLR4、TLR7/8和TLR3激动剂刺激后检测TNF和IL-6分泌；免疫印迹检测TRAF6蛋白。
Nlrc3−/−巨噬细胞中TRAF6 K63泛素化和NF-κB活化的检测
验证NLRC3缺失是否导致内源TRAF6 K63泛素化增加及NF-κB信号增强。
LPS刺激野生型和Nlrc3−/−骨髓来源巨噬细胞，免疫沉淀内源TRAF6，用K63泛素特异性抗体检测泛素化；共聚焦显微镜检测p65核转位；免疫印迹检测p65磷酸化和IκBα降解；检测p38、Erk、Jnk磷酸化。
Nlrc3−/−小鼠内毒素休克模型
评估NLRC3在体内对LPS诱导的全身炎症反应的作用。
野生型和Nlrc3−/−小鼠腹腔注射LPS（4.5 mg/kg）或PBS，监测体温和体重10天（每天三次）；24或48小时后处死，收集血清和腹腔灌洗液检测细胞因子，实时PCR检测腹腔细胞Il6、Tnf、Il1b mRNA，Wright-Giemsa染色分析腹腔细胞组成。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证NF-κB转录活性
验证基因表达变化
验证蛋白泛素化
验证细胞因子分泌
验证细胞定位
构建与鉴定基因敲除小鼠
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养与转染 | FuGENE6转染试剂 | Roche | -- |
| 共免疫沉淀 | V5琼脂糖珠 | Sigma | -- |
| UltraLink Protein A/G珠 | Pierce | -- | |
| 免疫印迹 | 抗Flag辣根过氧化物酶抗体（M2） | Sigma | -- |
| 抗V5辣根过氧化物酶抗体（R961-25） | Invitrogen | R961-25 | |
| 抗TRAF6抗体（D-10） | Santa Cruz | -- | |
| 抗TRAF6抗体（H-274） | Santa Cruz | -- | |
| 磷酸化IκBα抗体（2859S） | Cell Signaling Technology | 2859S | |
| 抗IκBα抗体（4812） | Cell Signaling Technology | 4812 | |
| K63连接泛素抗体（BML-PW0600） | Enzo Lifesciences | BML-PW0600 | |
| 抗肌动蛋白辣根过氧化物酶抗体（C-1 1） | Santa Cruz | -- | |
| 实时PCR | RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | -- |
| Superscript III逆转录酶 | Invitrogen | -- | |
| RNase抑制剂 | Roche | -- | |
| 小鼠Taqman基因表达检测试剂 | Applied Biosystems | -- | |
| 共聚焦显微镜 | 抗p65抗体（D14E12） | Cell Signaling | -- |
| Alexa Fluor 546标记的抗兔抗体（A-11035） | Invitrogen | A-11035 | |
| Hoechst 33342核酸染料 | -- | -- | |
| Zeiss LSM 710激光扫描共聚焦显微镜 | Zeiss | LSM 710 | |
| 酶联免疫吸附实验 | 人TNF酶联免疫吸附实验试剂 | eBioscience | -- |
| 小鼠TNF酶联免疫吸附实验试剂 | BD Bioscience | -- | |
| 小鼠构建 | pCR2.1-TOPO载体 | Invitrogen | -- |
| 快速DNA连接试剂盒 | Roche | -- | |
| Takara LA Taq DNA聚合酶 | Takara | -- | |
| PvuII限制性内切酶 | New England Biolabs | -- | |
| Zetaprobe尼龙膜 | Bio-Rad | -- | |
| Prime-a-Gene标记系统 | Promega | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 荧光素酶报告基因实验 | HEK293T细胞转染的NF-κB荧光素酶报告基因量（150 ng）、NLRC3剂量（0、100或250 ng）、激活质粒（250 ng）及检测时间（转染后24小时） 阅读提示：Online Methods的Luciferase assay小节及Figure 1a图注 |
| THP-1稳定细胞系构建与LPS刺激 | shNLRC3序列、过表达载体、LPS刺激浓度与时间、TNF/IL6 mRNA检测方法及归一化基因（ACTB） 阅读提示：Online Methods的Stable overexpressing and knockdown THP-1 lines小节及Figure 1b-e图注 |
| NLRC3与TRAF6共免疫沉淀 | V5-TRAF6和HA-NLRC3瞬转条件、抗V5琼脂糖免疫沉淀、NLRC3 TRAF结合位点1和2的突变方案 阅读提示：Online Methods的Cell culture, transfection, coimmunoprecipitation and immunoblot analysis小节及Figure 2a,d图注 |
| TRAF6泛素化实验 | 1% SDS裂解煮沸15分钟、抗Myc或V5琼脂糖免疫沉淀、K48/K63泛素质粒、免疫印迹检测K63泛素抗体（BML-PW0600） 阅读提示：Online Methods的Ubiquitination assay小节及Figure 3c-f图注 |
| Nlrc3−/−小鼠构建与基因分型 | 同源重组靶向载体设计（替换外显子3）、129S6/Sv胚胎干细胞、C57BL/6回交九代、Southern blot探针和PCR引物 阅读提示：Online Methods的Generation of Nlrc3−/− mice and in vivo LPS treatment小节及Figure 4a,b图注 |
| Nlrc3−/−巨噬细胞细胞因子检测 | 腹腔巨噬细胞分离方法（非硫羟乙酸肉汤预激活）、LPS刺激1小时、TLR激动剂种类和浓度、TNF/IL-6 ELISA试剂盒来源 阅读提示：Online Methods的Cell culture小节和Enzyme-linked immunosorbent assay小节及Figure 5a图注 |
| 内毒素休克模型 | LPS剂量（4.5 mg/kg）、腹腔注射途径、体温和体重监测频率（每天三次，持续10天）、24/48小时取样、每组小鼠数量（9-16只） 阅读提示：Online Methods的Generation of Nlrc3−/− mice and in vivo LPS treatment小节及Figure 7a-d图注 |