建立ISR缺陷LUAD小鼠模型并评估肿瘤生长
验证p-eIF2α缺失对肺腺癌形成和生长的影响。
使用KRAS G12D、Tp53 shRNA及Eif2s1 S51A条件敲入等位基因小鼠，经气管内滴注CA2-Cre慢病毒诱导肺肿瘤，35周后超声成像评估肿瘤大小。
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整合应激反应将线粒体适应性与谱系重编程偶联以驱动癌症演化
Integrated stress response couples mitochondrial fitness with lineage reprogramming to drive cancer evolution.
实验完整度
高包含条件敲入小鼠肿瘤模型、单细胞转录组、谱系示踪、体外细胞功能、线粒体功能检测、PDX及人队列预后分析，具备功能与机制验证。
主要模型
KRAS G12D驱动、Tp53敲低的eIF2αS/S与eIF2αA/A小鼠肺腺癌模型 eIF2αS/A及Atf4+/−小鼠肺腺癌模型 MycON/OFF（KM）小鼠肺腺癌模型 KRAS G12C突变LUAD患者来源异种移植（PDX）NOG小鼠模型
重点核对
eIF2αS/S与eIF2αA/A小鼠在Cre-lentivirus气管内滴注后35周取材，超声评估肿瘤大小，每组n=6–7 ISRIB每日口服灌胃10 mg kg−1，溶剂含0.5%羟丙基甲基纤维素和0.1% Tween 80（pH 4.0），治疗4周 PDX模型在NOG小鼠皮下移植，ISRIB 10 mg kg−1每日口服灌胃8周，vehicle组n=17、ISRIB组n=18 MycON/OFF模型使用tamoxifen 1 mg/25 g体重每日腹腔注射或tamoxifen饮食，按8 h、24 h、7天及撤药后8 h、12 h、24 h取材 Seahorse XFe96检测OCR/ECAR，依次注射oligomycin 1 µM、FCCP 2 µM、antimycin A 0.5 µM与rotenone 0.5 µM
摘要
肿瘤向去分化细胞簇的进展在肿瘤内异质性和治疗耐药中起关键作用。虽然肿瘤微环境应激已被牵涉其中，但潜在机制仍不清楚。利用肺腺癌小鼠模型，我们证明整合应激反应（ISR）的激活——以eIF2磷酸化（p-eIF2）和ATF4诱导为标志——驱动肿瘤异质性。ISR激活促进高可塑性、未分化及前上皮-间质转化（pre-EMT）细胞簇的出现，这些细胞簇以ATF4和MYC活性升高为特征。该过程依赖MYC，并涉及ISR介导的对肺泡身份关键决定因子NKX2-1的抑制，以及线粒体完整性和代谢适应性调节因子CHCHD10的诱导。破坏p-eIF2–ATF4轴可诱导线粒体功能障碍，限制去分化并抑制肿瘤生长。在人肺腺癌中，ISR驱动的去分化与晚期疾病和不良预后相关，表明ISR是肿瘤进展中谱系重编程和代谢适应性的核心驱动因素。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 整合应激反应（ISR）是否以及如何驱动肺腺癌谱系重编程和肿瘤演化。
- 核心机制
- ISR通过p-eIF2α–ATF4轴，与MYC协同抑制肺泡身份决定因子NKX2-1并诱导CHCHD10，从而维持线粒体适应性并促进向高可塑性、未分化和pre-EMT状态去分化。
- 主要证据
- 小鼠LUAD模型的谱系示踪与单细胞转录组显示ISR激活促进晚期细胞簇出现；eIF2αA/A、eIF2αS/A和Atf4+/−肿瘤限制去分化并出现Mito-Dysf或更分化状态；体外实验显示p-eIF2α/ATF4缺失导致线粒体功能障碍，CHCHD10敲低重现该表型；ISRIB在自发模型和PDX中抑制肿瘤生长。
- 研究意义
- 作者提出ISR是LUAD谱系重编程和代谢适应性的核心驱动因素，并认为靶向ISR可能限制肿瘤演化和耐药亚群。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单细胞转录组解析肿瘤细胞状态与ISR特征
比较ISR完整与缺陷肿瘤的细胞簇组成及ISR活性分布。
分选GFP+/CD45−肺肿瘤细胞进行scRNA-seq，注释细胞簇并计算ISR、MYC、AT2等特征评分。
轨迹推断与命运决定点分析
确定AT2-like细胞向不同终末状态转变的轨迹及ISR作用节点。
使用CellRank、RNA velocity、PAGA和CytoTRACE2分析细胞命运概率、驱动基因及去分化程度。
ATF4与MYC功能验证
验证ATF4和MYC在ISR驱动去分化中的作用。
使用Atf4+/−和Atf4f/f条件等位基因、MycON/OFF模型，结合超声、scRNA-seq和IHC检测肿瘤生长及细胞状态变化。
体外培养肿瘤细胞及线粒体功能检测
评估ISR/ATF4/CHCHD10对LUAD细胞线粒体功能和生存的影响。
培养原代eIF2αS/S与eIF2αA/A肿瘤细胞，进行TEM、Seahorse、TMRM、MitoTracker、克隆形成及ATF4/Chchd10敲低实验。
ISRIB药理学抑制及PDX验证
评估药物抑制ISR对LUAD演化和肿瘤生长的影响。
对35周形成的eIF2αS/S肿瘤给予ISRIB或vehicle 4周，超声和scRNA-seq分析；在KRAS G12C PDX NOG小鼠中每日口服ISRIB 8周并检测肿瘤体积及IHC标志物。
人LUAD队列预后与临床相关性分析
评估ISR相关细胞状态标志物与人LUAD预后和分期的关系。
分析TCGA LUAD 539例、TempO-seq 706例非黏液性LUAD及KRAS突变亚组的生存数据，并将公共scRNA-seq数据与ISR特征映射。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫印迹 | 磷酸化eIF2α抗体（克隆E90） | Abcam | Ab32157 |
| eIF2α抗体（克隆L57A5） | Cell Signaling Technology | 2103 | |
| ATF4抗体 | Cell Signaling Technologies | 11815S | |
| CHCHD10抗体 | Proteintech | 25671-1-AP | |
| NKX2-1抗体（克隆EP1584Y） | Abcam | ab76013 | |
| 细胞色素c抗体（克隆D18C7） | Cell Signaling Technologies | 11940 | |
| UQCRFS1/RISP抗体 | Cell Signaling Technologies | 95231 | |
| 微管蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | T5168 | |
| 肌动蛋白抗体 | MP Biomedicals | ICN691001 | |
| DRP1抗体 | Cell Signaling Technologies | 8570 | |
| 磷酸化DRP1（Ser616）抗体（克隆D9A1） | Cell Signaling Technologies | 4494 | |
| PARK2/Parkin抗体 | Proteintech | 14060-1-AP | |
| PINK1抗体 | Proteintech | 23274-1-AP | |
| 线粒体功能检测 | 四甲基罗丹明甲酯 | Thermo Fisher Scientific | M20036 |
| MitoTracker Red CMXRos | Thermo Fisher Scientific | M7512 | |
| MitoTracker Deep Red | Thermo Fisher Scientific | M22426 | |
| Seahorse检测 | 寡霉素 | Sigma-Aldrich | O4876 |
| 鱼藤酮 | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| 磺基罗丹明B | Sigma-Aldrich | S1402 | |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Wisent | 350700CL |
| 胎牛血清 | Gibco | 12483020 | |
| 青霉素/链霉素 | Wisent | 420-201-EL | |
| 碳酸氢钠 | Gibco | 25080-094 | |
| 必需氨基酸 | Gibco | 11130-51 | |
| 非必需氨基酸 | Gibco | 11140-050 | |
| shRNA/siRNA干扰 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 动物实验 | 他莫昔芬 | Sigma | TS648 |
| 花生油 | Sigma | P2144 | |
| 他莫昔芬饲料 | Harlan Laboratories UK | TAM400 diet | |
| 异氟烷 | Covetrus | 2800025 | |
| 腺病毒Cre（Ad5CMVCre） | Viral Vector Core, University of Iowa | -- | |
| 组织消化 | Dispase II | Gibco | 17105041 |
| IV型胶原酶 | Gibco | 17104019 | |
| DNase I | Thermo Fisher Scientific | EN0521 | |
| 流式细胞术 | BUV395大鼠抗小鼠CD45抗体 | BD Biosciences | 564279 |
| PE抗小鼠谱系鸡尾酒抗体 | BioLegend | 133303 | |
| APC抗小鼠CD326（EpCAM）抗体 | BioLegend | 118214 | |
| APC/Cy7抗小鼠CD49b抗体 | BioLegend | 108920 | |
| 免疫组化 | ONECUT2抗体 | Proteintech | 21916-1-AP |
| 4EBP1抗体 | Cell Signaling Technology | 9644T | |
| OmniMap抗兔HRP检测系统 | Roche Tissue Diagnostics | 05269679001 | |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 568标记驴抗兔IgG（H+L）二抗 | Invitrogen | A10042 |
| DAPI | Roche | 10236276001 | |
| 单细胞测序建库 | Chromium Next GEM单细胞3′试剂盒v3.1 | 10x Genomics | -- |
| Chromium控制器 | 10x Genomics | -- | |
| 测序 | NovaSeq测序平台 | Illumina | -- |
| HiSeq 2500测序系统 | Illumina | -- | |
| RNA提取与建库 | RNeasy试剂盒 | Qiagen | -- |
| TruSeq链特异性总RNA文库制备试剂盒 | Illumina | -- | |
| 蛋白质组学 | Orbitrap Ascend三合一质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Vanquish Neo超高效液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Aurora C18色谱柱 | IonOpticks | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠LUAD模型建立与超声评估 | 小鼠品系与等位基因（KRAS+/LSL-G12D;fTg/0;eIF2αS/S或A/A）、CA2-Cre慢病毒气管内滴注、35周取材时间、超声设备型号及每组样本量 阅读提示：Methods的Transgenic mouse models and treatments及Fig. 1b图注 |
| ISRIB药理学处理 | ISRIB剂量10 mg kg−1、每日口服灌胃、溶剂组成（0.5%羟丙基甲基纤维素、0.1% Tween 80，pH 4.0）、治疗持续时间（自发模型4周、PDX 8周）及vehicle对照设计 阅读提示：Methods的Transgenic mouse models and treatments、PDX assay及Fig. 6a,e图注 |
| MycON/OFF模型时间线 | tamoxifen给药方式与剂量（1 mg/25 g体重每日腹腔注射或tamoxifen饮食）、MycON各时间点（8 h、24 h、7天）及MycOFF撤药后时间点（8 h、12 h、24 h）、每组小鼠数 阅读提示：Methods的Transgenic mouse models and treatments及Fig. 4a图注 |
| 原代LUAD细胞培养与体外线粒体检测 | 细胞系来源与培养基配方、Seahorse每孔4,000个细胞及抑制剂浓度与注射顺序、TMRM 20 nM/30 min、MitoTracker Red 10 nM/45 min、生物学重复数 阅读提示：Methods的Cell lines、Mitochondrial function assays及Fig. 5b,c,d图注 |
| 单细胞RNA测序与轨迹分析 | GFP+/CD45−分选策略、35周取材、10x Genomics建库版本、质量控制阈值（UMI数、线粒体reads比例）、聚类与批次校正方法 阅读提示：Methods的Isolation of mouse LUAD cells、scRNA-seq及Supplementary Figs. 1、2、7、8 |
| 人LUAD队列预后分析 | TCGA LUAD n=539、TempO-seq LUAD n=706、KRAS突变亚组n=162、基因特征评分方法（ssGSEA）、 Cox模型协变量与分组切点 阅读提示：Methods的Human LUAD survival analysis及Fig. 7a–c图注 |