LTMS技术开发与优化
建立从细胞中捕获脂质-蛋白质相互作用并鉴定脂质的方法。
使用表达SEC61-GFP的HeLa细胞，比较超声与玻璃珠涡旋/注射器裂解条件，优化裂解和GFP-Trap磁珠免疫沉淀，通过荧光显微镜和Nile Red染色验证脂质结合。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
脂质陷阱质谱法鉴定细胞中的脂质-蛋白质相互作用
Lipid-trap mass spectrometry identifies lipid-protein interactions in cells.
实验完整度
高体外模型（HeLa细胞系、GUV脂质体）与体内细胞同步化模型结合，包含功能验证（脂质体结合实验）和机制验证（LTMS脂质组学、PIP衍生物化）。
主要模型
HeLa细胞系（稳定表达GFP标记蛋白） 同步化至胞质分裂期的HeLa细胞 巨大多层囊泡（GUV）脂质体模型
重点核对
细胞同步化：100 ng/ml诺考达唑处理12小时，有丝分裂摇落，释放120分钟后收集 LTMS裂解条件：无去垢剂PIPES缓冲液（20 mM pH 6.8），超声破碎（20秒开/30秒关，总3分钟，30 kHz），3500g离心10分钟 免疫沉淀：GFP磁珠（Chromotek）40 μl，4°C孵育1小时 脂质提取：中性脂质用CHCl3/MeOH（2:1, v/v）；磷酸肌醇用CHCl3/MeOH/HCl（1 M）（40:80:1, v/v/v） 对照：MyrPalm-GFP表达细胞平行实验，排除非特异性结合
摘要
细胞主动维持包含数千种脂质的复杂脂质组；然而，这些脂质的许多作用仍未被探索。脂质与膜蛋白之间的特异性相互作用可能是脂质组复杂性的一个原因。在此，我们报道了一种名为脂质陷阱质谱法（LTMS）的技术，用于系统研究直接从哺乳动物细胞中捕获的脂质-蛋白质相互作用。LTMS利用对在HeLa细胞中表达的GFP标记蛋白进行免疫沉淀，随后对与GFP标记蛋白结合的脂质进行脂质组学分析。我们将LTMS应用于细胞分裂以展示该技术。我们选择这一过程是因为膜在胞质分裂期间发生重大变化时调节其脂质组成，并且许多胞质分裂蛋白，包括RACGAP1和ESCRT-III组分CHMP4B和CHMP2A，是膜相关的。使用LTMS，我们发现RACGAP1和CHMP4B在分裂细胞中与非分裂细胞相比与特定脂质种类结合。我们扩展了对细胞分裂期间脂质多样性的理解，并提供了一种探索脂质-蛋白质相互作用的通用方法，以进一步了解脂质在哺乳动物细胞中的作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 是否可以利用LTMS系统研究哺乳动物细胞中膜相关蛋白与特定脂质的相互作用，并以胞质分裂为模型验证该技术？
- 核心机制
- 膜相关胞质分裂蛋白RACGAP1和CHMP4B在分裂细胞中与特定脂质种类（如PIPs、TGs、鞘脂）结合，且这种结合随细胞周期变化；RACGAP1通过C1结构域结合PIPs。
- 主要证据
- LTMS在HeLa细胞中鉴定出Lact-C2结合PS 18:1_18:1、TOM20结合心磷脂；RACGAP1和CHMP4B在同步化胞质分裂细胞中结合特定PIPs和TGs；脂质体沉淀实验证实CHMP4B与含PIP的GUV结合。
- 研究意义
- LTMS提供了一种通用方法，可在天然细胞环境中系统分析脂质-蛋白质相互作用，扩展了对细胞分裂期间脂质多样性的理解，并为研究脂质在哺乳动物细胞中的作用奠定基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
LTMS有效性验证（已知脂质-蛋白质相互作用）
验证LTMS能否鉴定已知的脂质-蛋白质相互作用。
建立稳定表达Lact-C2-GFP和TOM20-GFP的HeLa细胞系，进行LTMS，以MyrPalm-GFP为对照，脂质组学MS鉴定结合脂质。
RACGAP1脂质结合分析（细胞周期依赖性及C1结构域）
研究RACGAP1在胞质分裂期是否与特定脂质结合，以及C1结构域的作用。
建立诱导型RACGAP1-GFP和RACGAP1-ΔC1-GFP HeLa细胞系，同步化至胞质分裂期，进行LTMS和PIP衍生物化，比较同步化与非同步化及全长与突变体的脂质结合。
CHMP4B和CHMP2A脂质结合分析
研究ESCRT-III组分CHMP4B和CHMP2A在胞质分裂期的脂质结合特性。
使用稳定表达GFP-CHMP4B和CHMP2A-L-GFP的HeLa细胞，同步化至胞质分裂期，进行LTMS，比较同步化与非同步化细胞的脂质结合，并进行PIP衍生物化。
CHMP4B与PIP相互作用的脂质体结合验证
在无细胞系统中验证CHMP4B与PIP的直接结合。
制备POPC、POPC/PI(3)P（90/10）和POPC/PI(4)P（90/10）GUV，与部分纯化的GFP-CHMP4B孵育，超速离心分离，Western blot检测结合。
CHMP4B与TG相互作用的亚细胞定位分析
确定CHMP4B结合的TG在细胞中的分布。
瞬时转染BFP-LiveDrop标记新生脂滴，观察与CHMP4B共定位；超速离心分离细胞组分，进行LTMS分析TG结合。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | -- |
| 胎牛血清 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 遗传霉素（G418） | Gibco, Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 诱导表达 | 多西环素 | Sigma-Aldrich | -- |
| 细胞同步化 | 诺考达唑 | Sigma-Aldrich | -- |
| 免疫荧光 | 小鼠抗α-微管蛋白抗体 | Thermo Fisher | 236 10501 |
| Western blot | 小鼠抗RACGAP1抗体 | Everest Biotech | EB05315 |
| 小鼠抗GAPDH抗体 | Proteintech | 10494-1-AP | |
| 小鼠抗GFP抗体 | Abcam | ab1218 | |
| 兔抗GFP抗体 | Abcam | ab6556 | |
| 兔抗CHMP4B抗体 | Abcam | ab76334 | |
| 免疫荧光 | Alexa 488兔和鼠二抗 | Jackson ImmunoResearch | AB_2340846; AB_2338871 |
| Alexa 594兔和鼠二抗 | Jackson ImmunoResearch | AB_2313584; AB_2338046 | |
| DAPI | -- | -- | |
| 脂质染色 | 尼罗红 | Thermo Fisher | N1142 |
| LTMS免疫沉淀 | GFP磁珠 | Chromotek | -- |
| PIP衍生物化 | PI(4)P脑脂质分析内标 | Avanti Polar Lipids | -- |
| PI(3,4)P2脑脂质分析内标 | Avanti Polar Lipids | -- | |
| 全细胞脂质提取 | SPLASH脂质组学质谱标准品 | Avanti Polar Lipids | 330707 |
| Pierce BCA蛋白测定 | Thermo Scientific | 23225 | |
| GUV制备 | POPC | Avanti Polar Lipids | -- |
| 18:0-20:4 PI(3)P | Avanti Polar Lipids | -- | |
| PI(4)P脑混合物 | Avanti Polar Lipids | -- | |
| 蔗糖 | Fluorochem | -- | |
| 葡萄糖 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 脂质体结合实验 | 甘氨酸-HCl | -- | -- |
| 脂质组学分析 | Agilent 1290 Infinity II超高效液相色谱系统 | Agilent Technologies | -- |
| Agilent 6550 iFunnel四极杆飞行时间质谱仪 | Agilent Technologies | -- | |
| Acquity UHPLC CSH C18色谱柱 | Waters | -- | |
| 超分辨成像 | 配备NSPARC检测器的AXR点扫描共聚焦显微镜 | Nikon | -- |
| 共聚焦成像 | 配备Yokogawa CSU-X1转盘和Andor Neo sCMOS相机的Nikon Eclipse Ti显微镜 | Nikon; Yokogawa; Andor | -- |
| 超速离心 | Beckman Coulter Optima MAX XP超速离心机 | Beckman Coulter | -- |
| GUV制备 | Nanion Vesicle Prep Pro | Nanion Technologies | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞同步化 | 诺考达唑浓度100 ng/ml，处理12小时；有丝分裂摇落；释放120分钟；同步化效率约65% 阅读提示：Methods 'Cell cycle synchronization'；Extended Data Fig. 4 |
| LTMS裂解与免疫沉淀 | 裂解缓冲液20 mM PIPES pH 6.8（含1×蛋白酶抑制剂）；超声条件20秒开/30秒关，总3分钟，30 kHz；3500g离心10分钟；GFP磁珠40 μl，4°C孵育1小时 阅读提示：Methods 'LTMS pulldowns'；Fig. 1 |
| 脂质提取与PIP衍生物化 | 中性脂质：CHCl3/MeOH（2:1, v/v）；PIP：CHCl3/MeOH/HCl（1 M）（40:80:1, v/v/v）；PIP衍生物化：TMS-重氮甲烷（2 M）30分钟室温 阅读提示：Methods 'LTMS lipid extraction from beads'和'Phosphoinositide derivatization' |
| 脂质组学LC-MS分析 | 色谱柱Acquity UHPLC CSH C18（100×2.1 mm, 1.7 μm），65°C，流速0.6 ml/min；梯度B 15%→99%；QTOF质量范围50–1700 m/z；碰撞能量25 eV（正模式）/-20 eV（负模式） 阅读提示：Methods 'Lipidomics analysis by LC–QTOF' |
| 脂质体结合实验 | GUV组成POPC 100%、POPC/PI(3)P（90/10）、POPC/PI(4)P（90/10）；GUV 65 nmol/50 μg与GFP-CHMP4B 20 μg室温孵育30分钟；100,000g离心30分钟 阅读提示：Methods 'Liposome binding assay'；Fig. 4c；Extended Data Fig. 6e |
| RACGAP1诱导表达 | 多西环素1 μg/ml，诱导1小时 阅读提示：Methods 'Cell culture'和'LTMS pulldowns'；Fig. 3a |