靶向CRISPR–Cas9筛选鉴定顺铂敏感性驱动因子
在eHAP iCas9细胞中筛选参与顺铂损伤代谢及决定PrimPol缺陷细胞顺铂敏感性的基因。
使用pool 1（染色质与端粒相关基因）和pool 2（DNA损伤反应相关基因）两个sgRNA文库在eHAP iCas9 WT和PrimPol KO细胞中进行顺铂处理与未处理的差异筛选，用MaGeCK算法分析sgRNA丰度变化。
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RPA耗竭激活SLFN11以清除复制应激增强的细胞
RPA exhaustion activates SLFN11 to eliminate cells with heightened replication stress.
实验完整度
高包含CRISPR–Cas9全基因组及靶向筛选、多细胞系基因敲除、回补、Western blot、QIBC成像和流式凋亡检测
主要模型
eHAP诱导型Cas9细胞系（WT及PrimPol KO、SLFN11 KO克隆） A673、HEK293A、HeLa Kyoto、HT-1080、TOV112D、NCI-H460等细胞系 RPE-1 p53 KO细胞
重点核对
稳转诱导型Cas9 eHAP细胞中PrimPol KO克隆经Western blot和Sanger测序验证 回补实验：PrimPol KO细胞表达WT、AxA催化死亡突变体或CH引物酶死亡突变体并用misFIT系统将表达量调至近内源水平 各基因型在指定浓度顺铂下处理5 d（A673为7 d），Cell Titer Glo测定活力 SI-QIBC中细胞以10,000（顺铂24 h）或15,000（ST1926时间序列）细胞/孔接种并加10 μM BrdU 流式凋亡检测：顺铂或GCN2i处理后40 h，cleaved caspase-3染色定量
摘要
SLFN11在约半数癌症中因表观遗传沉默而介导化疗耐药。在复制应激下，SLFN11触发翻译关闭和不依赖p53的凋亡，但DNA损伤如何激活SLFN11仍不清楚。本文通过基于CRISPR的筛选，发现SLFN11是缺乏引物酶-聚合酶PrimPol介导的重新起始（repriming）的细胞对顺铂敏感性的关键决定因素。SLFN11及其下游的整合应激反应（ISR）特异性地促进PrimPol缺陷细胞中顺铂驱动的凋亡。我们证明，当PrimPol失活时，复制蛋白A（RPA）耗竭和单链DNA暴露触发SLFN11激活和细胞死亡。我们进一步鉴定出USP1–WDR48去泛素化酶复合物是PrimPol缺陷细胞中SLFN11激活的正向调节因子，揭示细胞对Fanconi贫血通路的依赖以解决顺铂损伤。最后，我们证明化学抑制DNA聚合酶α导致快速RPA耗竭可激活SLFN11依赖的细胞死亡。总之，我们的结果提示RPA耗竭是在复制应激增强时激活SLFN11的一般机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在缺乏PrimPol介导重新起始的细胞中，顺铂如何激活SLFN11从而诱导细胞死亡，其上游触发机制是什么？
- 核心机制
- 复制叉处单链DNA积累导致RPA耗竭和未包被ssDNA暴露，进而激活SLFN11的tRNA核酸酶活性，引起核糖体停滞、GCN2依赖的整合应激反应和不依赖p53的凋亡；USP1–WDR48通过下调Fanconi贫血通路促进RPA耗竭。
- 主要证据
- 在eHAP iCas9细胞中进行靶向CRISPR–Cas9筛选，鉴定SLFN11和USP1为PrimPol KO细胞顺铂敏感性的决定因素；SLFN11、GCN2缺失或USP1缺失均完全挽救PrimPol KO细胞的顺铂敏感性；QIBC显示PrimPol KO细胞顺铂处理后RPA耗竭细胞比例升高十余倍，siRNA敲低RPA2导致SLFN11–GCN2依赖的顺铂增敏；DNA聚合酶α抑制剂ST1926诱导RPA耗竭和SLFN11依赖的ATF4激活及细胞死亡。
- 研究意义
- 提出RPA耗竭作为SLFN11在复制应激增强时激活的一般机制，并解释SLFN11在超过50%未经治疗肿瘤中频繁表观遗传沉默的原因，即癌细胞通过沉默SLFN11逃避RPA耗竭诱导的死亡以存活。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
PrimPol KO细胞系构建与表型验证
验证PrimPol缺失是否特异性地赋予顺铂、BPDE和MMC敏感性。
在eHAP iCas9中构建PrimPol KO克隆并经Western blot验证，进行生长曲线、Cell Titer Glo活力检测；用WT PrimPol、AxA催化死突变体或CH引物酶死突变体回补，并用misFIT系统调节表达量；检测多种基因毒物和DDR抑制剂的敏感性。
SLFN11–GCN2轴依赖性验证
确定PrimPol KO细胞中顺铂敏感性是否依赖SLFN11及其下游GCN2–ISR通路。
在WT或PrimPol KO细胞中瞬时敲除SLFN11，或在顺铂处理时加入固定剂量GCN2抑制剂A-92，通过Cell Titer Glo、集落形成实验和流式cleaved caspase-3凋亡检测评价；构建SLFN11双敲除细胞并回补WT及tRNA核酸酶、ssDNA结合、解旋酶突变体；检测染色质结合RPA pSer33、γH2AX、RAD51和SLFN11、pGCN2。
RPA耗竭检测与功能验证
验证顺铂是否引起RPA耗竭，以及RPA耗竭是否足以激活SLFN11–GCN2依赖的细胞死亡。
用QIBC同时定量非变性BrdU标记的ssDNA与染色质结合RPA32，判断偏离线性关系的RPA耗竭细胞比例；用siRNA梯度敲低RPA2，在加或不加GCN2i条件下检测顺铂敏感性；用DNA-PK抑制剂NU7441检验SLFN11缺失细胞中RPA耗竭后DSB经NHEJ致死的通路。
USP1–WDR48调控机制验证
验证USP1缺失是否通过上调FA通路减少RPA耗竭并限制SLFN11依赖的凋亡。
瞬时敲除USP1或WDR48或使用USP1抑制剂ML323，检测顺铂敏感性、RPA耗竭、cleaved caspase-3凋亡；联合敲除RAD18或FANCL检验通路归属，免疫荧光检测FANCD2焦点。
DNA聚合酶α抑制诱导RPA耗竭和SLFN11激活
验证DNA聚合酶α抑制是否通过RPA耗竭以PrimPol非依赖方式激活SLFN11。
在eHAP iCas9 WT或SLFN11 KO细胞中用ST1926处理，QIBC检测RPA耗竭并以染色质结合ATF4作为SLFN11激活替代指标；在HeLa Kyoto、HT-1080、TOV112D、A673和eHAP等表达不同SLFN11水平的细胞系中检测ST1926的SLFN11依赖性细胞死亡。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Iscove改良Dulbecco培养基 | Gibco | 12440053 |
| 无四环素胎牛血清 | Pan Biotech | P30-3602 | |
| 青霉素–链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| Dulbecco改良Eagle培养基 | Gibco | 41966029 | |
| Dulbecco改良Eagle/F12培养基 | Gibco | 11320033 | |
| Eagle最低必需培养基 | LGC | 30-2003 | |
| 罗斯威尔帕克纪念研究所1640培养基 | Gibco | 11530586 | |
| 药物处理 | 顺铂 | Sigma-Aldrich | P4394 |
| 羟基脲 | Sigma-Aldrich | H627 | |
| 多西环素 | Sigma-Aldrich | M0503 | |
| 杀稻瘟菌素 | Thermo Fisher Scientific | A1113903 | |
| 嘌呤霉素 | Thermo Fisher Scientific | A1113803 | |
| 苯并[a]芘二醇环氧化物 | Santa Cruz | sc-503767 | |
| 奥拉帕利 | Selleckchem | S1060 | |
| 阿非迪霉素 | Sigma-Aldrich | A0781 | |
| ST1926 | Sigma-Aldrich | SML2061 | |
| 博来霉素 | Sigma-Aldrich | B8416 | |
| 甲磺酸甲酯 | Thermo Fisher Scientific | H55120.06 | |
| RAD51抑制剂B02 | Selleckchem | S8434 | |
| ATR抑制剂AZD6738 | Selleckchem | S7693 | |
| 喜树碱 | Selleckchem | S1288 | |
| ATM抑制剂KU-55933 | Selleckchem | S1092 | |
| GCN2抑制剂A-92 | Axon Medchem | 2720 | |
| USP1抑制剂ML323 | Selleckchem | S7529 | |
| DNA-PK抑制剂NU7441 | Selleckchem | S2638 | |
| siRNA转染 | ON-TARGETplus SMARTPool非靶向siRNA | Horizon Discovery | D-001810-10-05 |
| 靶向人RPA2的siRNA | Horizon Discovery | L-017058-01-0005 | |
| siRNA稀释缓冲液 | Dharmacon | B-002000-UB-100 | |
| Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 13778150 | |
| 质粒与cDNA | PrimPol cDNA | OriGene | SC100629 |
| pDONR221质粒 | Thermo Fisher Scientific | 12536017 | |
| pLEX_307目的载体 | Addgene | 41392 | |
| Q5定点突变试剂盒 | NEB | -- | |
| pLenti-sgRNA-puro载体 | Addgene | 139462 | |
| pLentiCRISPRv2载体 | Addgene | 52961 | |
| 慢病毒感染 | 聚凝胺 | Sigma-Aldrich | H9268 |
| 诱导型Cas9细胞系构建 | Edit-R诱导型慢病毒Cas9质粒 | Dharmacon or Horizon | CAS11229 |
| Cas9活性检测 | pKLV2-U6gRNA5(gGFP)-PGKBFP2AGFP-W质粒 | Addgene | 67980 |
| pKLV2-U6gRNA5(gGFP)-PGKmCherry2AGFP-W质粒 | Addgene | 67982 | |
| 基因型鉴定 | PureLink基因组DNA小量提取试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | K182001 |
| Western blot | Phos-Stop磷酸酶抑制剂混合物 | Roche | 4906845001 |
| cOmplete无EDTA蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 11836170001 | |
| NuPAGE LDS上样缓冲液（4×） | Thermo Fisher Scientific | NP0008 | |
| NuPAGE 4–12% Bis–Tris SDS–PAGE梯度胶 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| NuPAGE 3–8% Tris-乙酸梯度胶 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Clarity或ClarityMAX化学发光试剂 | BioRad | -- | |
| BioRad ChemDoc成像系统 | BioRad | -- | |
| PrimPol17抗体 | Proteintech | 29824-1-AP | |
| PCNA抗体 | Santa Cruz | sc-56 | |
| vinculin抗体 | Sigma-Aldrich | V9131 | |
| RPA32 pS33抗体 | Bethyl | A300-246A | |
| RPA32抗体 | abcam | ab2175 | |
| Chk1 pSer345抗体 | Cell Signaling Technology | 9664S | |
| Chk1抗体 | Sigma-Aldrich | C9358 | |
| pGCN2 T899抗体 | abcam | 75836 | |
| SLFN11抗体 | Santa Cruz | sc-374339 | |
| 甘油醛3-磷酸脱氢酶抗体 | Abcam (6C5) | ab8245 | |
| USP1抗体 | Bethyl | A301-699A | |
| USP1抗体 | Proteintech | 14346-1-AP | |
| WDR48抗体 | Proteintech | 16503-1-AP | |
| PCNA Ub K164抗体 | Cell Signaling Technology | 13439 | |
| SMC1抗体 | abcam | ab21583 | |
| RAD18抗体 | Bethyl | A301-340A | |
| FANCL抗体 | Santa Cruz | sc-137067 | |
| FANCD2抗体 | abcam | ab108928 | |
| 活力检测 | Cell Titer Glo均一溶液检测试剂 | Promega | G8462 |
| 96孔白色不透明发光检测板 | Greiner | 655098 | |
| BMG LabTech ClarioStar酶标仪 | BMG LabTech | -- | |
| 生长曲线 | Countess 3细胞计数仪 | -- | -- |
| CRISPR筛选 | AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | A63800 |
| Illumina测序 | Illumina | -- | |
| 集落形成实验 | 结晶紫染液 | -- | -- |
| Oxford Optronix GelCount集落计数仪 | Oxford Optronix | -- | |
| 流式凋亡检测 | 96孔圆底板 | Falcon | 353263 |
| BD PhosFlow固定缓冲液I | BD Biosciences | 557870 | |
| BD PhosFlow透化缓冲液III | BD Biosciences | 558050 | |
| 山羊血清 | Thermo Fisher Scientific | G6767 | |
| 兔抗cleaved caspase-3抗体 | BD Biosciences | 570524 | |
| 山羊抗兔Alexa Fluor-647二抗 | Thermo Fisher Scientific | A-21244 | |
| 35 μm滤网 | Thermo Fisher Scientific | 10585801 | |
| 高内涵免疫荧光 | PerkinElmer PhenoPlate 96孔板 | PerkinElmer (now Revvity) | -- |
| RAD51抗体 | Millipore | ABE257 | |
| γH2AX磷酸化Ser139抗体 | Millipore clone JBW301 | 05-636 | |
| 山羊抗鼠Alexa Fluor-488二抗 | Invitrogen | A-11029 | |
| 山羊抗兔Alexa Fluor-647二抗 | Invitrogen | A-21245 | |
| Operetta CLS共聚焦高内涵系统 | -- | -- | |
| QIBC | BrdU抗体 | BD Biosciences | 555627 |
| RPA32抗体 | CST | 2208 | |
| ATF4抗体 | CST | 11815 | |
| γH2AX–pSer139抗体 | CST | 2577 | |
| 山羊抗大鼠Alexa Fluor-647二抗 | Thermo Fisher Scientific | A-21247 | |
| HCA山羊抗鼠Alexa Fluor-488二抗 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | |
| HCA驴抗兔Alexa Fluor-568二抗 | Thermo Fisher Scientific | A10042 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CRISPR–Cas9靶向筛选 | sgRNA文库组成（pool 1/2基因数）、MOI=0.2、每sgRNA至少500细胞、多西环素1 μg/ml诱导6 d、顺铂450 nM处理6 d、生物学三重复 阅读提示：Methods“Targeted CRISPR–Cas9 screening”及Fig. 1a图注 |
| PrimPol KO表型与回补 | 顺铂剂量（生长曲线450/550 nM；Cell Titer Glo剂量反应）、处理时间5 d、回补构建体种类及misFIT表达调节、n=3–4生物学重复 阅读提示：Fig. 1e–l图注及Methods“MisFIT cloning to tune PrimPol expression” |
| SLFN11–GCN2依赖性验证 | GCN2抑制剂A-92固定剂量750 nM（凋亡实验为650 nM）、顺铂处理24 h（免疫荧光）或40 h（凋亡流式）、SLFN11回补水平 阅读提示：Fig. 3图注与Extended Data Fig. 3、4图注 |
| RPA耗竭QIBC检测 | 顺铂2.5 μM处理24 h、BrdU 10 μM预标记、细胞接种密度10,000/孔、RPA耗竭判定为BrdU/RPA32信号偏离线性、n=3生物学重复 阅读提示：Methods“QIBC”及Fig. 4c,d图注 |
| USP1–WDR48调控实验 | ML323剂量4.5 μM（A673为16.5 μM）、所有QIBC实验在SLFN11缺陷细胞中进行、FANCD2焦点检测顺铂450 nM 阅读提示：Fig. 5及Extended Data Fig. 6–8图注 |
| DNA聚合酶α抑制实验 | ST1926处理1 h与4 h的QIBC时间序列、ATF4high阈值（ATF4阳性细胞上四分位）、SLFN11表达水平不同的细胞系、n=3生物学重复 阅读提示：Fig. 6、7图注及Methods“QIBC” |