纳米结构诱导质膜曲率
模拟T小管形态，精确控制质膜曲率。
制备垂直石英纳米柱（直径200–300 nm，高2 μm，间距2.5 μm）和纳米条（高2 μm，宽200–300 nm，长5 μm，间距10 μm），培养细胞于其上，诱导质膜内陷。
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质膜曲率调控内质网-质膜接触的形成
Plasma membrane curvature regulates the formation of contacts with the endoplasmic reticulum.
实验完整度
高包含iPSC-CMs、U2OS、HEK293T、HeLa、大鼠胚胎CMs及多种功能验证，如FIB-SEM、ExM、敲低、共免疫沉淀等。
主要模型
人诱导多能干细胞来源心肌细胞（iPSC-CMs） U2OS细胞 大鼠胚胎心肌细胞 HEK293T和HeLa细胞
重点核对
纳米柱/纳米条诱导质膜曲率（直径200–300 nm，高度2 μm） JPH2/JPH3等蛋白在纳米条末端的富集比值（end-to-side ratio） EHD1/2/4三基因敲低对JPH3曲率偏好的抑制 甲基-β-环糊精（MβCD）处理破坏EHD定位并降低JPH3曲率偏好 共免疫沉淀验证EHD4与8MORN_LCR相互作用
摘要
内质网（ER）与质膜（PM）之间的接触位点在钙调节和脂质稳态中起关键作用。尽管其重要性显著，但调控其在质膜上空间分布的因素仍不清楚。受心肌细胞中观察到的现象启发——ER-PM接触位点集中于称为横小管的管状质膜内陷上——我们假设质膜曲率在ER-PM接触形成中发挥作用。通过精确控制质膜内陷，我们证明质膜曲率在心肌细胞中局部诱导ER-PM接触的形成。有趣的是，特异性表达于可兴奋细胞中的亲联蛋白家族ER-PM拴系蛋白是这一过程中的关键角色，而普遍表达的延伸突触结合蛋白2则未表现出对质膜曲率的偏好。在机制层面，我们发现亲联蛋白的低复杂度区域（LCR）和膜占据与识别Nexus（MORN）基序可以独立结合质膜，但LCR和MORN基序均为靶向质膜曲率所必需。通过检测亲联蛋白相互作用组，我们鉴定出一类曲率感应蛋白——含Eps15同源结构域的蛋白——它们与MORN_LCR基序相互作用并促进亲联蛋白优先拴系至弯曲质膜。这些发现突显了质膜曲率在心肌细胞ER-PM接触形成中的关键作用，并揭示了一种通过质膜曲率调控实现ER-PM接触空间调控的机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 质膜曲率是否以及如何调控内质网-质膜接触位点的空间分布？
- 核心机制
- 质膜曲率通过JPH的MORN_LCR基序与曲率感应蛋白EHDs相互作用，促进JPH介导的ER-PM接触在弯曲质膜处优先形成。
- 主要证据
- 利用垂直纳米结构在iPSC-CMs和U2OS细胞中诱导质膜曲率，结合FIB-SEM、ExM和免疫荧光显示JPH2/JPH3在弯曲质膜富集；EHD敲低或胆固醇去除破坏该富集；共免疫沉淀证实EHD4与8MORN_LCR结合。
- 研究意义
- 揭示了质膜曲率调控ER-PM接触空间分布的机制，为理解T小管富集ER-PM接触及相关钙信号异常疾病提供线索。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证ER-PM接触组分在弯曲质膜的富集
检测JPH2、RyR2、Cav1.2等dyad组分是否在纳米柱/条诱导的弯曲质膜处富集。
在iPSC-CMs和U2OS细胞中进行免疫荧光染色，共表达GFP-Sec61β、BFP-CAAX等标记，量化纳米柱/条与平坦区域的荧光强度比值。
FIB-SEM和ExM直接观察ER-PM接触
在纳米尺度直接可视化弯曲质膜处的ER-PM接触。
使用聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM）和膨胀显微镜（ExM）对纳米柱周围的ER-PM接触进行成像和定量。
JPH与E-Syt2的曲率偏好比较
确定JPH家族是否特异性地偏好弯曲质膜，而E-Syt2不偏好。
在U2OS、HEK293T和HeLa细胞中表达GFP-JPH2/3/4或GFP-E-Syt2，量化纳米条末端的富集比值。
STIM1/ORAI1在弯曲质膜ER-PM接触的定位
验证弯曲质膜处形成的ER-PM接触是否具有功能性钙信号组分。
在U2OS细胞中共表达GFP-JPH3与mCherry-STIM1或GFP-ORAI1，使用2 μM毒胡萝卜素（Tg）耗竭ER钙，观察STIM1和ORAI1在纳米条末端的聚集。
JPH3结构域截短与突变分析
鉴定JPH3中负责质膜结合和曲率感知的基序。
构建JPH3截短体（Δ8MORNΔLCR、Δ8MORN、LCR、LCR-KRtoA、LCR-TM、ΔLCR、8MORN、8MORN-αHelix、8MORN_LCR等）并转染U2OS细胞，量化纳米条末端富集。
EHD家族在JPH曲率偏好中的作用验证
确定EHD蛋白是否介导JPH的曲率感知。
shRNA敲低EHD1/2/4、clathrin、CAVIN1或CAV1/2，或用10 mM甲基-β-环糊精处理，检测JPH3在纳米条末端的富集变化；共免疫沉淀验证EHD4与8MORN_LCR结合。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | 11965-092 |
| 胎牛血清 | Sigma–Aldrich | F4135 | |
| RPMI培养基 | Gibco | 11875-093 | |
| B27添加剂 | Gibco | 17504-044 | |
| iPSC-CM分化 | 基质胶 | Corning | 356231 |
| Accutase细胞解离液 | Sigma–Aldrich | -- | |
| Y-27632 ROCK抑制剂 | Selleck Chemicals | -- | |
| CHIR-99021 | Selleck Chemicals | -- | |
| IWR-1 | Selleck Chemicals | -- | |
| 纳米芯片细胞培养 | 多聚-L-赖氨酸 | -- | -- |
| 人血浆纤连蛋白 | Sigma–Aldrich | 341635 | |
| DMEM/F-12 + GlutaMAX培养基 | Gibco | 10565-018 | |
| KnockOut血清替代物 | Gibco | A31815-01 | |
| 大鼠胚胎CM分离 | HBSS缓冲液 | Gibco | 14025126 |
| TrypLE Select 10× | Gibco | A12177-01 | |
| 免疫荧光 | 抗亲联蛋白-2抗体 | Sigma–Aldrich | HPA052646 |
| 抗RyR2抗体 | Novus Bio | NB1202827 | |
| 抗Cav1.2抗体 | Sigma–Aldrich | C1103 | |
| 抗α-辅肌动蛋白抗体 | Sigma–Aldrich | A7811 | |
| 抗钙网蛋白抗体 | Invitrogen | PA3-900 | |
| 抗EHD4抗体 | Thermo Fisher Scientific | 50-172-7111 | |
| 免疫荧光和免疫印迹 | 抗EHD2抗体 | Cusabio | CSB-PA873710LA01HU-20UG |
| 免疫印迹 | 抗小窝蛋白-1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-70516 |
| 抗小窝蛋白-2抗体 | Cusabio | CSB-PA004572LA01HU-20UG | |
| 抗EHD1抗体 | Cusabio | CSB-PA884470LA01HU-20UG | |
| 抗网格蛋白抗体 | Invitrogen | MA1-065 | |
| 抗BIN1抗体 | Sigma–Aldrich | SAB1408547 | |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 594-山羊抗兔IgG | Invitrogen | A11012 |
| Alexa Fluor 647-山羊抗小鼠IgG | Invitrogen | A32728 | |
| 免疫印迹 | 抗GFP抗体 | Invitrogen | A-11122 |
| 抗mCherry抗体 | Sigma–Aldrich | SAB2702291 | |
| HRP标记山羊抗兔IgG (H+L)抗体 | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| HRP标记山羊抗小鼠IgG (H+L)抗体 | Cell Signaling Technology | 7076 | |
| 药物处理 | 甲基-β-环糊精 | Sigma–Aldrich | C4555 |
| 毒胡萝卜素 | Sigma–Aldrich | T9033 | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | 11668-019 |
| Nucleofector II电转仪 | Lonza Amaxa Biosystems | -- | |
| Western blotting | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | Roche | 04693159001 and 04906837001 | |
| Trans-Blot Turbo转膜系统 | Bio-Rad | 1704150 | |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | -- | -- |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| Expansion microscopy | Acryloyl-X, SE | Invitrogen | A20770 |
| 丙烯酸钠 | -- | -- | |
| 蛋白酶K | -- | -- | |
| 共免疫沉淀 | GFP-Trap磁珠琼脂糖 | ChromoTek | -- |
| cOmplete蛋白酶抑制剂 | Roche | -- | |
| PhosSTOP磷酸酶抑制剂 | Roche | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 纳米结构诱导质膜曲率 | 纳米柱/条的直径、高度、间距、材质（石英），细胞接种密度和培养时间 阅读提示：Methods中'Nanopillar and nanobar fabrication'和'Cell culture on nanochips'小节，以及图1a、1j和3a的图注。 |
| JPH2/JPH3在弯曲质膜的富集量化 | 荧光强度比值计算中纳米柱/条末端与侧壁或平坦区域的掩膜定义，表达水平筛选标准（排除过低或过高表达），背景扣除方法 阅读提示：Methods中'Nanopillar and nanobar averaging and end-to-side ratio quantification'小节，图1g、1l、3e、5l的图注。 |
| EHD敲低实验 | shRNA序列、敲低效率验证（Western blot）、敲低后检测时间（第3天），以及EHD1/2/4三基因同时敲低的组合 阅读提示：Methods中'shRNA interference experiments'和'Western blotting'小节，Extended Data Fig. 5c的图注。 |
| 甲基-β-环糊精处理 | MβCD浓度（10 mM）、处理温度（37°C）和时间（30分钟） 阅读提示：Methods中'Antibodies and reagents'小节，图6d、6e和Extended Data Fig. 6a的图注。 |
| 共免疫沉淀验证EHD4与8MORN_LCR相互作用 | 交联剂浓度（0.5 mM DSP）、裂解缓冲液、抗体用量、孵育时间 阅读提示：Methods中'Co-immunoprecipitation assay'小节，图6i的图注。 |