• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构：
    • 成为企业机构
    • 个人用户：
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
搜文献

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购

        神经退行性疾病中WIPI4缺失导致不依赖自噬的铁死亡

        Loss of WIPI4 in neurodegeneration causes autophagy-independent ferroptosis.

        作者信息Ye Zhu, Motoki Fujimaki, Louisa Snape, Ana Lopez, Angeleen Fleming, David C Rubinsztein
        PMID38454050
        期刊Nat Cell Biol
        发布时间2024-04
        DOI10.1038/s41556-024-01373-3
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        细胞系、iPSC神经元、原代神经元、斑马鱼多模型；功能验证（铁死亡抑制剂、脂质过氧化）与机制验证（ATG2A突变体、脂质转移、PISD）。

        主要模型

        SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞系 HeLa细胞系及其CRISPR敲除衍生株 人iPSC来源的i3神经元和小鼠原代皮层神经元 rho:EGFP转基因斑马鱼

        重点核对

        siWIPI4（J-019758）转染浓度20-100 nM，处理72小时 铁死亡抑制剂Fer-1（1 µM）和Lip-1（100 nM）处理48小时 斑马鱼wdr45 CRISPR注射量0.64/0.96 ng，Fer-1 10 µM从5 dpf处理至10 dpf LDH释放和MDA水平作为铁死亡检测终点 ATG2A/B敲除或敲低对WIPI4缺失诱导铁死亡的挽救

        摘要

        β-螺旋蛋白相关神经退行性病（BPAN）是一种罕见的X连锁显性疾病，是表现为神经退行和脑铁积累的多种疾病之一。编码WIPI4的WD重复域45（WDR45）基因突变导致BPAN功能丧失，但触发病理的细胞机制尚不清楚。文献中主流观点认为BPAN仅仅是自噬缺陷的结果，因为WIPI4在此降解途径中发挥作用。然而，我们的数据表明，WIPI4耗竭引起铁死亡——一种由脂质过氧化诱导的细胞死亡类型——通过不依赖自噬的机制，在细胞培养和斑马鱼中均得到证实。WIPI4耗竭增加ATG2A在内质网-线粒体接触位点的定位，从而增强磷脂酰丝氨酸进入线粒体的输入。这导致线粒体磷脂酰乙醇胺（一种易发生过氧化的主要脂质）合成增加，从而引发铁死亡。该机制与经典铁死亡刺激的重叠极小，但为BPAN神经退行性变的病因提供了见解，并可能为治疗策略提供线索。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        BPAN中WIPI4功能丧失如何触发神经退行性病理，是否取决于自噬缺陷？
        核心机制
        WIPI4缺失增加ATG2A在内质网-线粒体接触位点的定位，促进磷脂酰丝氨酸向线粒体转运，线粒体PISD将其转化为磷脂酰乙醇胺，增加的磷脂酰乙醇胺作为脂质过氧化底物诱发铁死亡，该过程不依赖自噬。
        主要证据
        在SH-SY5Y、HeLa、iPSC神经元、原代神经元和斑马鱼中，WIPI4缺失诱导的铁死亡被铁死亡抑制剂挽救，不被自噬抑制挽救；ATG2A/B敲除、 mitoPISD敲低或PISD抑制剂可挽救；ATG2A突变体（ΔMLD、YFS、LTD）验证了线粒体定位和脂质转移功能的需求。
        研究意义
        揭示了BPAN神经退行性变的一种不依赖自噬的铁死亡机制，PISD抑制可能为BPAN及其他与铁死亡相关疾病提供治疗线索。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        WIPI4缺失诱导铁死亡的细胞模型验证

        验证WIPI4缺失是否引起细胞死亡并确定死亡类型

        在SH-SY5Y、HeLa细胞中转染siWIPI4或CRISPR敲除WDR45，检测LDH释放、细胞活力、MDA和BODIPY581/591C11脂质过氧化，并用铁死亡、凋亡、坏死抑制剂处理。

        2

        iPSC来源神经元和原代神经元验证

        在更接近神经元的模型中验证WIPI4缺失诱导铁死亡

        人iPSC分化的i3神经元和小鼠原代皮层神经元感染shWIPI4慢病毒，检测细胞死亡和脂质过氧化，并用Fer-1处理。

        3

        斑马鱼体内验证WIPI4缺失诱导铁死亡

        在体内验证wdr45缺失是否诱导铁死亡和光感受器退化

        在rho:EGFP斑马鱼中注射wdr45 CRISPR，检测光感受器面积、MDA水平和生存率，并用Fer-1处理。

        4

        验证铁死亡不依赖自噬

        检验WIPI4缺失诱导的铁死亡是否依赖自噬通路

        在ATG16L1敲除、Beclin 1敲除细胞或ULK1/2抑制剂处理细胞中敲低WIPI4，检测LDH释放；斑马鱼中共注射atg7 CRISPR。

        5

        验证ATG2在WIPI4缺失诱导铁死亡中的作用

        确定WIPI4缺失诱导的铁死亡是否依赖ATG2

        在ATG2A/B敲除或敲低细胞中敲低WIPI4，检测LDH释放和MDA；过表达ATG2A或突变体（ΔMLD、YFS、LTD），检测细胞死亡和MDA。

        6

        验证ATG2A在线粒体定位和脂质转移功能

        明确ATG2A线粒体定位及脂质转移功能对铁死亡的必要性

        细胞分级、免疫共沉淀、超分辨显微镜检测ATG2A定位；用GFP-ATG2A突变体检测线粒体PE水平和细胞死亡；斑马鱼注射ATG2A构建体检测形态异常。

        7

        验证线粒体PE合成和PISD的作用

        确定线粒体PE水平增加和PISD在铁死亡中的作用

        检测线粒体PE、PC、PS和不饱和脂肪酸水平；使用mitoPISD siRNA、inPISD抑制剂或过表达mitoPISD，检测细胞死亡、MDA和PE水平；用NBD-PS追踪线粒体PE合成。

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        验证细胞死亡和铁死亡
        乳酸脱氢酶释放实验细胞活力检测丙二醛检测BODIPY581/591C11染色流式细胞术IncuCyte活细胞成像
        验证分子表达和定位
        蛋白质印迹免疫沉淀免疫荧光显微镜超分辨显微镜邻近连接实验细胞分级分离
        验证脂质代谢变化
        磷脂检测不饱和脂肪酸检测脂质体制备和NBD-PS负载线粒体PE合成活细胞成像
        体内验证
        斑马鱼CRISPR-Cas9显微注射生存分析斑马鱼视网膜冰冻切片和成像定量PCR
        数据分析和统计
        Student t检验对数秩检验皮尔逊相关系数

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        细胞培养DMEM培养基MerckD6546
        胎牛血清MerckF7524
        L-谷氨酰胺MerckG7513
        青霉素和链霉素MerckP0781
        DMEM-F12培养基MerckD6421
        MEM非必需氨基酸Thermo Fisher11140050
        Western blot兔抗WDR45（WIPI4）抗体Proteintech19194-1-AP
        小鼠抗α-微管蛋白抗体Sigma Aldrich9026
        兔抗肌动蛋白抗体Sigma AldrichA2066
        兔抗ATG2A抗体MBL Life SciencePD041
        兔抗GFP抗体Abcamab6556
        小鼠抗NDUFA9抗体Abcamab14713
        兔抗Sec23a抗体Abcamab137583
        兔抗TOMM20抗体Abcamab186735
        小鼠抗GM130抗体Abcamab52649
        小鼠抗LAMP1抗体Abcamab24170
        兔抗KDEL抗体Abcamab2898
        小鼠抗β III微管蛋白抗体[2G10]Abcamab78078
        兔抗LC3抗体Proteintech14600-1-AP
        小鼠抗TOMM40抗体Santa Cruz Biotechnologysc-365467
        兔抗TMEM41b抗体Novus BiologicalsNBP1-81552
        兔抗钙网蛋白抗体Cell Signaling Technologies12238
        兔抗切割型caspase 3抗体Cell Signaling Technologies9661
        兔抗ATG16L1抗体Cell Signaling Technologies8089
        兔抗ATG7抗体Cell Signaling Technologies2631
        兔抗MAP2抗体Cell Signaling Technologies8707S
        兔抗PISD抗体Atlas AntibodiesHPA031091
        免疫荧光小鼠抗TOMM20抗体Santa Cruzsc-17764
        小鼠抗钙联蛋白抗体Abcamab112995
        兔抗hNIX抗体Cell Signaling Technologies12396
        小鼠单克隆FLAG M2抗体SigmaF1804-200UG
        小鼠抗ORP8抗体Santa Cruzsc-134409
        兔抗ORP5抗体Atlas AntibodiesHPA038712-100UL
        兔抗IP3受体1抗体(D53A5)Cell Signaling Technologies8568
        小鼠单克隆[20B12AF2]抗VDAC1/Porin + VDAC3抗体Abcamab14734
        药物处理Z-VAD-fmkPromegaG7231
        necrostatin-1SigmaN9037
        liproxstatin-1SigmaSML1414
        Fer-1SigmaSML0583
        N-乙酰-L-半胱氨酸SigmaA7250
        MitoTEMPOSigmaSML0737
        甲磺酸去铁胺盐MerckD9533
        星形孢菌素SigmaS5921
        erastinSigmaE7781
        1S,3R-RSL3SigmaSML2234
        iFSP1SigmaSML2749
        花生四烯酸Sigma10931
        FIN56SigmaSML1740
        索拉非尼Santa Cruzsc-220125
        inPISD抑制剂Vitasmlab.biz--
        米托蒽醌醇Cayman Chemicals89950
        CCCPSigmaC2759
        ULK1抑制剂SBI-0206965SigmaSML1540-5MG
        脂质过氧化检测BODIPY FL C12InvitrogenD3822
        BODIPY581/591C11InvitrogenD3861
        线粒体脂质过氧化检测MitoPerOxAbcamab146820
        线粒体质量检测壬基吖啶橙Thermo Fisher ScientificA1372
        质粒构建pEGFP-C1-hATG2A质粒Addgene36456
        pSpCas9n(BB)-2A-GFP (PX458)质粒Addgene48138
        转染TransIT-2020转染试剂MirusMIR5400
        Lipofectamine RNAiMAX转染试剂Invitrogen13778
        定点突变QuickChange多位点定点突变试剂盒Agilent Technologies200515
        Q5定点突变试剂盒NEBE0554
        慢病毒包装Lipofectamine LTX转染试剂（含plus试剂）Thermo Fisher15338100
        细胞活力检测AquaBluer细胞活力检测试剂MultiTarget Pharmaceuticals LLC6015
        细胞毒性检测LDH检测试剂盒Abcamab65393
        细胞死亡检测CellTox绿色细胞毒性检测PromegaG8743
        活细胞成像IncuCyte Cytotox红色染料Sartorius4632
        MDA检测脂质过氧化检测试剂盒Abcamab118970
        磷脂检测PE检测试剂盒Abcamab241005
        PC检测试剂盒Sigma-AldrichMAK049
        PS检测试剂盒Abcamab273295
        脂质提取脂质提取试剂盒（无氯仿）Abcamab211044
        不饱和脂肪酸检测脂质检测试剂盒（不饱和脂肪酸）Abcamab242305
        免疫荧光MitoTracker深红色FMThermo ScientificM22426
        ProLong金抗淬灭封片剂Thermo FisherP10144
        含DAPI的ProLong金抗淬灭封片剂Thermo FisherP36941
        流式细胞术BODIPY581/591C11InvitrogenD3861
        脂质体负载18:1-12:0 NBD磷脂酰丝氨酸Avanti Polar Lipids810195C
        18:0-16:0磷脂酰胆碱Avanti Polar Lipids850465
        活细胞成像MitoTracker红色CMXRosThermo FisherM7512
        Duramycin-Cy5偶联物Molecular Targeting TechnologiesD-1002
        Seahorse XF-PMPAgilent102504-100
        斑马鱼注射Cas9核酸酶蛋白NLSHorizon DiscoveryCAS12206
        TRACR RNADharmaconU002005
        斑马鱼麻醉MS222----

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        WIPI4缺失诱导铁死亡的细胞实验
        siWIPI4寡核苷酸J-019758使用浓度20-100 nM，处理时间72小时；Fer-1 1 µM、Lip-1 100 nM处理48小时
        阅读提示：Methods中“Transfection”和“Cell cytotoxicity assay”小节，以及Fig. 1a图注
        斑马鱼wdr45敲低和Fer-1处理
        wdr45 CRISPR注射量0.64/0.96 ng；Fer-1 10 µM从5 dpf处理至10 dpf；生存分析每组60条鱼
        阅读提示：Methods中“CRISPR–Cas9 micro-injections”和“Drug treatment of zebrafish”小节，以及Fig. 2a,b图注
        ATG2A/B敲除细胞中铁死亡检测
        ATG2A/B-KO HeLa细胞；GFP-ATG2A-WT、ΔMLD、YFS、LTD瞬转24小时；Fer-1 1 µM或Lip-1 100 nM处理20小时
        阅读提示：Methods中“Transfection”和“Mutagenesis”小节，以及Fig. 3g,h和图5e,f图注
        线粒体PE合成检测
        NBD-PS脂质体比例75:25% PC:NBD-PS；负载50分钟；Seahorse XF-PMP 2 nM处理15分钟
        阅读提示：Methods中“Preparation of liposomes”和“Measurement of de novo mitochondrial PE synthesis”小节，以及Fig. 7f,g图注
        PISD抑制挽救实验
        inPISD 5 µM预处理12小时；mitoPISD siRNA 50-100 nM转染48-72小时
        阅读提示：Methods中“Drugs”和“Constructs and siRNA oligonucleotides”小节，以及Fig. 6j和图7a图注

        关于丁香通

        公司信息

        个人用户

        企业机构

        无忧采购 轻松科研

        无忧采购 轻松科研