构建MLL3敲除乳腺癌细胞模型
验证MLL3缺失对转移的影响
用lentiviral CRISPR在MDA-MB-231、MDA-MB-435s、SUM159、MCF7、T47D、HMLE等细胞中敲除MLL3，并通过Western blot验证。
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MLL3缺失通过促进杂交上皮-间质转化状态驱动转移
MLL3 loss drives metastasis by promoting a hybrid epithelial-mesenchymal transition state.
实验完整度
高包含多种细胞系体外实验、小鼠体内转移模型、患者样本分析、组学及功能机制验证。
主要模型
MDA-MB-231乳腺癌细胞系 MCF7乳腺癌细胞系 MDA-MB-435s乳腺癌细胞系 SUM159乳腺癌细胞系 T47D乳腺癌细胞系 HMLE永生化人乳腺上皮细胞 小鼠乳腺干细胞类器官（Trp53null/Pik3caH1047R） NOD/SCID和NSG小鼠转移模型
重点核对
MLL3敲除效率通过Western blot验证 转移 burden通过生物发光成像和器官离体成像定量 杂交EMT细胞频率通过CD44+CD104high流式分析和VIM/Ecad免疫荧光检测 IFNγ信号通路通过IFNGR1敲除或阻断抗体验证功能必要性 BET抑制剂JQ1和GSK525762的剂量反应及体内抑瘤效果
摘要
与杂交上皮-间质转化（EMT）相关的表型可塑性对转移性播散和生长至关重要。然而，调控杂交EMT状态的机制仍不清楚。我们发现，表观遗传调控因子MLL3（一种在人类癌症中频繁改变的抑癌基因）的缺失促进了乳腺癌细胞获得杂交EMT。与其他仅介导单向变化的EMT调控因子不同，MLL3缺失分别增强了上皮细胞和间质细胞中对诱导EMT和间质-上皮转化（MET）刺激的反应。因此，MLL3缺失通过增强转移性定植而大大增加了转移。在机制上，MLL3缺失导致IFNγ信号增强，这有助于诱导杂交EMT细胞并增强转移能力。此外，BET抑制有效抑制了MLL3突变原发肿瘤和转移瘤的生长。这些结果揭示了MLL3突变是乳腺癌中杂交EMT和转移的关键驱动因素，并可作为治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- MLL3缺失如何调控乳腺癌的杂交EMT状态和转移？
- 核心机制
- MLL3缺失通过增加IFNγ信号通路活性，上调EMT转录因子，促进杂交EMT细胞的诱导和转移定植。
- 主要证据
- 在多种乳腺癌细胞系和小鼠模型中，MLL3敲除增强转移；IFNGR1敲除或阻断取消MLL3缺失对杂交EMT和转移的增强作用；ChIP-seq和ATAC-seq显示MLL3缺失增加IFNγ响应基因增强子的H3K27ac。
- 研究意义
- 揭示MLL3突变作为杂交EMT和转移的关键驱动因素，并提示BET抑制可能靶向MLL3突变癌症。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体内自发转移和实验性转移评估
检测MLL3缺失对原发瘤生长和远处转移的影响
将MLL3-WT或突变细胞原位注射或尾静脉注射到免疫缺陷或同系小鼠，通过生物发光成像、H&E和免疫组化评估转移负荷。
杂交EMT状态检测
验证MLL3缺失是否促进杂交EMT细胞的产生
通过免疫荧光检测VIM和Ecad共表达，流式细胞术检测CD44+CD104high细胞频率，以及在forskolin或TGF-β1处理下评估MET或EMT诱导。
IFNγ信号通路功能验证
确定IFNγ信号在MLL3缺失诱导的杂交EMT和转移中的作用
用IFNγ处理细胞，或用IFNGR1阻断抗体或CRISPR敲除IFNGR1，检测对杂交EMT细胞频率、肿瘤起始和转移的影响。
表观遗传和转录组分析
探究MLL3缺失增强IFNγ信号的分子机制
进行RNA-seq、ATAC-seq、ChIP-seq（H3K27ac、H3K4me1、H3K4me3、MLL3/4、UTX）和ChIP-qPCR，分析IFNγ响应基因增强子的变化。
BET抑制剂敏感性测试
评估MLL3突变细胞对BET抑制的敏感性
用JQ1和GSK525762处理MLL3-WT或突变细胞，检测细胞活力和肿瘤生长，并在体内用JQ1治疗移植瘤和转移瘤。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | Corning | -- |
| 胎牛血清 | HyClone | -- | |
| 抗生素-抗真菌溶液 | HyClone | -- | |
| 乳腺上皮细胞生长培养基 | Lonza | -- | |
| DMEM/F-12培养基 | Corning | -- | |
| 表皮生长因子 | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| 胰岛素 | Sigma-Aldrich | 91077C | |
| 氢化可的松 | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| 肿瘤球培养 | B27添加剂 | Gibco | 17504044 |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | EMD Millipore | GF003 | |
| 肝素 | Sigma | H4784 | |
| 乳腺类器官培养 | 基质胶 | Corning Life Sciences | 354234 |
| Y-27632 | Cayman Chemical Company | 10005583 | |
| 热灭活胎牛血清 | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Advanced DMEM/F12培养基 | Life Technologies | -- | |
| 慢病毒CRISPR | lentiCRISPRv2载体 | Addgene | 52961 |
| lentiCRISPRv2-GFP载体 | Addgene | 82416 | |
| 动物实验 | 17β-雌二醇 | Sigma-Aldrich | E8875 |
| 循环肿瘤细胞和外渗分析 | FITC标记蓖麻凝集素I | Vector Laboratories | FL-1081 |
| Western blot | 抗MLL3抗体 | Millipore Sigma | ABE1851 |
| 抗E-钙粘蛋白抗体（克隆36） | BD Biosciences | 610182 | |
| 抗波形蛋白抗体（克隆D21H3） | Cell Signaling Technology | 5741S | |
| 抗Slug抗体（克隆C19G7） | Cell Signaling Technology | 9585S | |
| 抗Snail抗体（克隆C15d3） | Cell Signaling Technology | 3879S | |
| 抗Zeb1抗体（克隆D80D3） | Cell Signaling Technology | 3396S | |
| 抗Stat1抗体（克隆D1K9Y） | Cell Signaling Technology | 14994S | |
| 抗磷酸化Stat1(Tyr701)抗体（克隆58D6） | Cell Signaling Technology | 9167S | |
| 抗β-肌动蛋白抗体（克隆C4/actin） | BD Biosciences | 612656 | |
| 抗H3K27ac抗体（克隆D5E4） | Cell Signaling Technology | 8173S | |
| 抗H3K4me1抗体（克隆D1A9） | Cell Signaling Technology | 5326S | |
| 抗H3K4me3抗体（克隆C42D8） | Cell Signaling Technology | 9751S | |
| 抗组蛋白H3抗体（克隆1B1B2） | Cell Signaling Technology | 14269S | |
| 肺转移肿瘤细胞分离 | 3型胶原酶 | Worthington Biochemical | LS004182 |
| 透明质酸酶 | Worthington Biochemical | LS002592 | |
| DNase I | Roche | 104159 | |
| 红细胞裂解液 | eBioscience | 00-4300-54 | |
| 中性蛋白酶 | Worthington Biochemical | LS02109 | |
| 流式细胞术 | 抗CD44抗体（克隆G44-26） | BD Bioscience | 559942 |
| 抗CD24抗体（克隆ML5） | BD Bioscience | 555428 | |
| 生物素化CD104抗体（ITGB4，克隆439-9B） | eBioscience | 13-1049-82 | |
| 抗人IFNGR1抗体（克隆GIT208） | Leinco Technologies | I443 | |
| 免疫荧光和免疫组化 | 抗Ki67抗体 | EMD Millipore | AB9260 |
| 抗 cleaved caspase 3 抗体（克隆5A1E） | Cell Signaling Technology | 9664S | |
| 抗人线粒体抗体（克隆113-1） | EMD Millipore | MAB1273 | |
| 抗角蛋白8抗体 | Developmental Studies Hybridoma Bank | AB_531826 | |
| 抗α-平滑肌肌动蛋白抗体（克隆1A4） | Biolegend | 904601 | |
| 免疫组化 | ImmPRESS HRP山羊抗小鼠IgG聚合物试剂 | Vector Laboratories | MP-7402 |
| DAB/HRP检测免疫组化试剂盒 | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| 化学筛选和细胞活力检测 | 表观遗传化合物库 | Cayman | 11076 |
| 细胞计数试剂盒-8 | Dojindo | CK04-13 | |
| alamar blue检测 | Invitrogen | DAL1025 | |
| 体内JQ1治疗 | JQ1 | Dr. James E Bradner from Dana-Farber Cancer Institute | -- |
| 定量RT-PCR | Quick-RNA微量RNA提取试剂盒 | Zymo Research | R1050 |
| Direct-zol RNA小量制备Plus试剂盒 | Zymo Research | R2072 | |
| High-Capacity cDNA逆转录试剂盒 | Applied Biosystems | 4368814 | |
| SYBR Green PCR预混液 | Applied Biosystems | 4368708 | |
| ChIP-seq | 抗H3K4me1抗体（克隆D1A9） | Cell Signaling Technology | 5326S |
| 抗H3K4me3抗体（克隆C42D8） | Cell Signaling Technology | 9751S | |
| 抗H3K27ac抗体 | Active Motif | 39133 | |
| 甲醛 | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| 蛋白酶抑制剂 | Roche | 11836170001 | |
| 磷酸酶抑制剂 | Thermo | 78427 | |
| Dynabeads磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 10009D | |
| 蛋白酶K | NEB | P8107S | |
| QIAquick PCR纯化试剂盒 | QIAGEN | 28104 | |
| NEBNext® Ultra II DNA文库构建试剂盒 | NEB | E7103S | |
| NEBNext®多重寡核苷酸用于Illumina®（索引引物套装1） | NEB | E7335S | |
| UTX和MLL4 ChIP-seq | 果蝇spike-in染色质 | Active Motif | 53083 |
| 果蝇特异性组蛋白变体H2Av spike-in抗体 | Active Motif | 61686 | |
| Dynabeads蛋白A磁珠 | Invitrogen | 10002D | |
| NEBNext Ultra™ II DNA文库构建试剂盒用于Illumina | NEB | E7645 | |
| ChIP-qPCR | 抗STAT1抗体（克隆D1K9Y） | Cell Signaling Technology | 14994S |
| 兔IgG（克隆DA1E） | Cell Signaling Technology | 3900S | |
| 抗H3K27ac抗体（克隆D5E4） | Cell Signaling Technology | 8173S |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| MLL3敲除细胞模型构建 | sgRNA序列、敲除效率验证、细胞系来源及代数 阅读提示：Methods: Lentiviral CRISPR-mediated gene knockout；Extended Data Fig. 2a, 2g, 2k |
| 体内转移实验 | 细胞接种数量、注射途径、小鼠品系和周龄、监测时间点、转移负荷定量方法 阅读提示：Methods: Metastasis assays和Orthotopic tumor cell implantation；图1-2图注 |
| 杂交EMT检测 | CD44+CD104high流式门控策略、VIM/Ecad免疫荧光抗体和定量方法、forskolin处理浓度和时间 阅读提示：Methods: Flow cytometry and sorting和Immunofluorescence；图3图注 |
| IFNγ信号功能验证 | IFNγ处理浓度和时间、IFNGR1敲除效率、阻断抗体浓度和处理时间 阅读提示：Methods: Lentiviral CRISPR-mediated gene knockout和Flow cytometry；图6图注；Extended Data Fig. 6 |
| BET抑制剂体内治疗 | JQ1剂量、给药途径和频率、治疗持续时间、肿瘤体积监测方法 阅读提示：Methods: In vivo JQ1 treatment；图8图注 |