构建Hippo通路组分敲除细胞并评估重金属毒性
探究Hippo通路在重金属诱导细胞毒性中的作用。
用CRISPR/Cas9构建LATS1/2 DKO、MOB1A/B DKO、NF2 KO、MST1/2 DKO HEK293A细胞，用不同重金属处理，通过结晶紫染色和相对活力定量评估细胞存活。
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Hippo通路激酶LATS1和LATS2通过磷酸化MTF1减弱细胞对重金属的响应
The Hippo pathway kinases LATS1 and LATS2 attenuate cellular responses to heavy metals through phosphorylating MTF1.
实验完整度
高包含细胞模型、小鼠模型、果蝇模型及患者样本分析，并进行了功能验证和机制验证
主要模型
HEK293A细胞（野生型及LATS1/2 DKO等） Hep3B细胞 MCF10 DCIS细胞 CdCl2染毒小鼠模型
重点核对
CdCl2和ZnCl2处理浓度：CdCl2 50 μM，ZnCl2 250 μM（细胞活力实验处理12小时） LATS1/2 DKO细胞对Cd/Zn的LC50：Cd ~80 μM，Zn ~280 μM；野生型细胞：Cd ~6 μM，Zn ~170 μM MTF1 S152为LATS1磷酸化位点，S152A增加MTF1转录活性，S152D抑制其活性 小鼠CdCl2腹腔注射剂量5 mg/kg，XMU-MP-1 3 mg/kg，Verteporfin 100 mg/kg ChIP实验中使用S蛋白珠沉淀SFB-MTF1，q-PCR检测MT1F和ZNT2启动子结合
摘要
重金属既是细胞的组成部分，也是环境毒物，其失调与严重的细胞功能障碍和多种疾病相关。本文中，我们展示Hippo通路在调控重金属稳态中起关键作用。Hippo信号缺陷促进重金属响应基因转录并保护细胞免受重金属诱导的毒性，这一过程不依赖于其经典下游效应分子YAP和TAZ。机制上，Hippo通路激酶LATS磷酸化并抑制MTF1——重金属响应中的关键转录因子，导致重金属响应基因转录丧失和细胞保护作用缺失。此外，重金属处理会抑制LATS活性，其中积累的锌直接结合并抑制LATS。综上所述，我们的研究揭示了Hippo通路与重金属之间的相互作用，为这一生长相关通路在组织稳态和应激响应中的作用提供了见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Hippo通路是否以及如何调控细胞对重金属的响应。
- 核心机制
- LATS激酶磷酸化MTF1的S152位点，抑制MTF1与重金属响应基因启动子的结合，从而抑制重金属响应基因转录；重金属处理导致锌积累，锌直接结合LATS并抑制其活性，进而激活MTF1介导的重金属响应。
- 主要证据
- 在HEK293A等细胞中，LATS1/2敲除增强重金属响应基因转录并抵抗Cd/Zn毒性；体外激酶实验证实LATS1磷酸化MTF1 S152；ChIP实验显示LATS缺失增强MTF1与启动子结合；小鼠实验中XMU-MP-1抑制Hippo通路可提高CdCl2染毒小鼠存活率并诱导MT1表达。
- 研究意义
- 揭示了Hippo通路在重金属响应和解毒中的新功能，将Hippo通路与重金属稳态联系起来，并提示Hippo通路可能作为重金属解毒的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
转录组分析鉴定Hippo通路调控的重金属响应基因
确定Hippo信号缺陷对重金属响应基因表达的影响。
对野生型和LATS1/2 DKO HEK293A细胞进行Cd/Zn处理，提取RNA进行RNAseq和GO分析，并用q-PCR验证MT、ZNT、ZIP家族基因表达。
验证MTF1在Hippo通路介导的重金属响应中的作用
明确MTF1是否介导Hippo通路对重金属响应基因的调控。
在LATS1/2 DKO细胞中敲除MTF1，检测细胞活力和重金属响应基因转录；用MRE荧光素酶报告基因检测MTF1转录活性；用ChIP检测MTF1与启动子结合。
鉴定LATS1对MTF1的磷酸化位点
确定LATS1磷酸化MTF1的具体位点。
纯化LATS1和MTF1截短体进行体外激酶实验，结合质谱鉴定磷酸化位点，用点突变和磷酸化抗体验证S152位点。
验证S152磷酸化对MTF1功能和重金属响应的影响
探究S152磷酸化是否抑制MTF1转录活性和重金属响应。
在LATS/MTF1 TKO或MTF1 KO细胞中回补MTF1及其S152A/S152D突变体，检测细胞活力、基因转录和启动子结合。
评估Hippo通路抑制剂XMU-MP-1对重金属解毒的作用
测试靶向Hippo通路是否能促进重金属解毒。
在Hep3B细胞和小鼠中，使用XMU-MP-1抑制Hippo通路，检测重金属响应基因表达和CdCl2染毒小鼠生存率。
验证重金属对Hippo通路的抑制及锌直接结合LATS
探究重金属是否抑制Hippo通路以及锌是否直接结合LATS。
用Cd/Zn处理细胞，检测LATS磷酸化；用金属珠结合实验和体外激酶实验检测锌与LATS的结合及对激酶活性的影响；用圆二色谱分析锌结合对LATS结构的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞活力
验证基因表达变化
验证蛋白-DNA相互作用
验证蛋白亚细胞定位
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| Western blot | 抗α-微管蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | T6199-200UL |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | A2228 | |
| 抗Flag（M2）抗体 | Sigma-Aldrich | F3165-5MG | |
| 抗Myc抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-40 | |
| 抗p300抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-585 | |
| 抗血凝素（HA）抗体 | BioLegend | 901503 | |
| 抗泛TEAD抗体 | Cell Signaling Technology | 13295S | |
| 抗磷酸化YAP（Ser127）抗体 | Cell Signaling Technology | 4911S | |
| 抗YAP/TAZ抗体 | Cell Signaling Technology | 8418S | |
| 抗磷酸化LATS1（Ser909）抗体 | Cell Signaling Technology | 9157S | |
| 抗磷酸化LATS1（Thr1079）抗体 | Cell Signaling Technology | 8654S | |
| 抗LATS1抗体 | Cell Signaling Technology | 3477S | |
| 抗磷酸化MST（Thr180/Thr183）抗体 | Cell Signaling Technology | 3681S | |
| 抗MST1抗体 | Cell Signaling Technology | 3682S | |
| 抗磷酸化MOB1（Thr35）抗体 | Cell Signaling Technology | 8699S | |
| 抗MOB1抗体 | Cell Signaling Technology | 3863S | |
| 抗NF2抗体 | Cell Signaling Technology | 12896S | |
| 抗KIBRA抗体 | Cell Signaling Technology | 8774S | |
| 抗SP1抗体 | Cell Signaling Technology | 9389S | |
| 抗CBP抗体 | Cell Signaling Technology | 7389S | |
| 抗C/EBPα抗体 | Cell Signaling Technology | 8178T | |
| 抗MTF1抗体 | Novus Biologicals | NBP1-86380 | |
| 体外激酶实验 | ATP-γ-S激酶底物 | Abcam | ab138911 |
| 对硝基苄基甲磺酸酯 | Abcam | ab138910 | |
| Western blot | 抗硫代磷酸酯抗体 | Abcam | ab92670 |
| 抗MAP4K4/HGK抗体 | Bethyl Laboratories | A301-502A-M | |
| 抗磷酸化MAP4K2（Ser170）抗体 | Kinexus | AB-PK646 | |
| 免疫荧光染色 | 抗YAP抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-101199 |
| 抗MTF1抗体 | Novus Biologicals | NBP1-86380 | |
| 免疫组织化学染色 | 抗MT1A抗体 | Novus Biologicals | NBP1-97493 |
| 抗切割型caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9579S | |
| 抗YAP抗体 | Cell Signaling Technology | 14074S | |
| 抗MTF1抗体 | Abcam | ab236401 | |
| 细胞处理 | 氯化钙 | Sigma-Aldrich | C7902 |
| 氯化镁 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| 氯化锰 | Sigma-Aldrich | M3634 | |
| 硫酸锌 | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
| 氯化钠 | Fisher Scientific | S271-3 | |
| 硫酸铜 | Acros Organics | 7758-98-7 | |
| 硝酸银 | Alfa Aesar | 11414 | |
| 维替泊芬 | Sigma-Aldrich | SML0534 | |
| TPEN | Sigma-Aldrich | P4413 | |
| 四硫代钼酸铵 | Sigma-Aldrich | 323446 | |
| 卡铂 | Sigma-Aldrich | C2538 | |
| XMU-MP-1 | Tocris | 6482 | |
| 顺铂 | Adipogen | AG-CR1-3590 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞活力检测 | 重金属处理浓度（CdCl2 50 μM，ZnCl2 250 μM，其他金属250 μM，AgNO3 50 μM）、处理时间（12小时）、细胞接种密度（相同数量细胞接种于12孔板） 阅读提示：Methods细胞活力检测部分；图1图注 |
| 基因表达分析 | Cd/Zn处理浓度（CdCl2 50 μM，ZnCl2 250 μM）、处理时间（4小时）、q-PCR内参（GAPDH）、RNA提取试剂（TRIzol） 阅读提示：Methods RNA提取与q-PCR部分；图2图注 |
| ChIP实验 | SFB-MTF1诱导表达条件（~50 ng/mL doxycycline）、Cd/Zn处理时间（2小时）、交联条件（1%甲醛10分钟）、S蛋白珠用量 阅读提示：Methods ChIP部分；图3n和图5e图注 |
| 小鼠CdCl2染毒与治疗 | 小鼠品系（C57BL/6，雌性，5周龄）、CdCl2剂量（5 mg/kg，腹腔注射）、XMU-MP-1剂量（3 mg/kg）、Verteporfin剂量（100 mg/kg）、给药时间点（CdCl2后1小时） 阅读提示：Methods小鼠Cd染毒实验部分；图6e图注 |
| 体外激酶实验 | 激酶纯化方法（S蛋白珠或免疫沉淀）、底物（GST-YAP、MBP-MTF1-R2、MBP-LATS1-C3）、ATP浓度（500 μM）、反应时间（30分钟，30°C） 阅读提示：Methods体外激酶实验部分 |