配体刺激下ERK的K63泛素化与激活相关性检测
探究K63泛素化是否与ERK1/2激活相关
IGF1或EGF刺激细胞后，用含SDS缓冲液裂解、稀释并进行变性免疫沉淀（d-IP），以K63连接特异性泛素抗体和磷酸化抗体检测ERK1/2
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TRIM15与CYLD通过赖氨酸63连接的多泛素化调控ERK激活
TRIM15 and CYLD regulate ERK activation via lysine-63-linked polyubiquitination.
实验完整度
高涵盖细胞系、MEF与基因敲除/敲低、体外泛素化与激酶实验、小鼠移植瘤及48例患者组织免疫组化等多层证据
主要模型
人黑色素瘤细胞系SK-MEL-28、A375、G361等 HEK293T与A549等工具细胞系 Cyld+/+与Cyld−/−小鼠胚胎成纤维细胞 小鼠皮下移植瘤模型与黑色素瘤PDX来源细胞系WM3960
重点核对
TRIM15敲除或敲低后内源性及Flag-ERK1的K63泛素化水平变化 ERK1 K168R/K302R（2KR）与ERK2 K149R/K283R突变体的泛素化及激酶活性 Flag-ERK1与Flag-ERK1Ub同MEK1DD结合的体外pull-down差异 A375异种移植中PLX4032 20 mg/Kg每日腹腔注射与TRIM15敲低的联合效果 48例人黑色素瘤标本中p-ERK1/2与TRIM15、CYLD免疫组化染色强度的相关性
摘要
细胞外信号调节激酶ERK1和ERK2代表哺乳动物细胞中最重要的促有丝分裂通路，其失调驱动肿瘤发生并赋予治疗耐药性。已知ERK1/2通过MAPK/ERK激酶（MEK）介导的磷酸化而被激活。本研究表明ERK1/2还可被赖氨酸63连接的多泛素链修饰。研究鉴定含三联基序蛋白TRIM15为ERK的泛素连接酶，肿瘤抑制因子CYLD为ERK的去泛素化酶。TRIM15和CYLD通过互斥性相互作用以及对立的活性，调控ERK在特定赖氨酸残基上的泛素化。K63连接的多泛素化增强ERK与MEK的相互作用及其被MEK激活。下调TRIM15抑制药物敏感和耐药黑色素瘤的生长。此外，TRIM15高表达和CYLD低表达与黑色素瘤患者不良预后相关。这些发现界定了K63连接多泛素化在ERK信号通路中的作用，并提示其作为癌症治疗的潜在靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 除MEK介导的磷酸化外，是否存在其他翻译后修饰直接调控ERK1/2的激活，以及何种酶负责该修饰。
- 核心机制
- TRIM15作为K63特异性泛素连接酶在ERK1的K302（ERK2对应K283）等赖氨酸残基上连接K63多泛素链，CYLD作为K63特异性去泛素化酶去除该链；二者通过CD结构域竞争结合ERK，K63泛素化增强ERK与MEK的相互作用从而促进MEK对ERK的磷酸化激活。
- 主要证据
- 细胞中TRIM15过表达/敲低/敲除改变ERK的K63泛素化与磷酸化；体外泛素化与激酶实验显示ERK1Ub较ERK1对MEK1DD结合更强、激酶活性更高；ERK12KR与ERK1K302R相互作用和活性减弱；CYLD敲低或敲除升高ERK泛素化与活性；小鼠移植瘤及PDX模型中TRIM15敲低抑制肿瘤生长。
- 研究意义
- 界定K63连接多泛素化在ERK信号通路中的作用，提示TRIM15可作为由ERK通路过度激活驱动的肿瘤的潜在药物靶点与预后标志物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
TRIM蛋白筛选鉴定ERK泛素连接酶
确定介导ERK K63泛素化的泛素连接酶
在HEK293T中共表达前18个人TRIM成员与Flag-ERK1，d-IP检测ERK1泛素化，进一步用TRIM15剂量递增、TRIM15ΔRB及泛素K63/K48突变体确认连接类型
确定ERK1/2的泛素化赖氨酸位点
明确TRIM15介导泛素化的具体赖氨酸残基
质谱分析纯化Flag-ERK1Ub鉴定修饰位点，构建系列Lys-to-Arg突变体，检测K168R、K302R及2KR的泛素化和激酶活性；在体外泛素化体系中验证
TRIM15与ERK相互作用结构域解析
确定TRIM15-ERK结合的结构基础
构建TRIM15缺失突变体和4A突变体、ERK1 2DN突变体，通过共免疫沉淀、GST pull-down和蔗糖梯度离心分析相互作用
K63泛素化促进ERK-MEK相互作用与激活
验证泛素化是否增强ERK与MEK结合及被MEK激活
比较Flag-ERK1与Flag-ERK1Ub、ERK12KR、ERK1K302R与MEK1或MEK1DD的结合，用ERK1AEF突变体检测对磷酸化的依赖，并进行体外激酶实验
鉴定CYLD为ERK的K63特异性去泛素化酶
寻找拮抗TRIM15的ERK去泛素化酶
在细胞和体外比较CYLD、CYLDCA、OTUD4、OTUD7B对ERK1泛素化的影响，利用CYLD siRNA/shRNA及Cyld−/− MEFs检测ERK泛素化与激活
CYLD与ERK相互作用及竞争机制
验证CYLD通过CD结构域竞争性抑制TRIM15-ERK及ERK-MEK结合
构建CYLD4A突变体和ERK12DN，共免疫沉淀及体外pull-down分析CYLD对TRIM15-ERK结合的阻断，检测CYLD敲低对ERK-MEK结合的影响
TRIM15在黑色素瘤细胞增殖与致瘤性中的作用
评估TRIM15对黑色素瘤生长的影响
TRIM15敲低或敲除的A375、SK-MEL-173细胞进行增殖、克隆形成和软琼脂实验，用shRNA抗性TRIM15及ERK1R84S进行回补，并建立小鼠异种移植模型
TRIM15在耐药黑色素瘤中的作用
考察TRIM15对BRAF抑制剂耐药黑色素瘤生存的影响
建立PLX4032耐药A375R细胞及PDX来源WM3960细胞，检测TRIM15敲低对ERK激活、增殖及异种移植肿瘤生长的影响
黑色素瘤标本中TRIM15/CYLD表达与预后分析
分析TRIM15、CYLD表达与ERK活性及患者预后的关系
对48例人黑色素瘤组织芯片进行TRIM15、CYLD与p-ERK1/2免疫组化及Pearson相关分析，并分析公共数据库表达与生存数据
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达与泛素化变化
验证信号通路特异性
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫印迹与免疫沉淀 | K63连接特异性多泛素抗体 | Cell Signaling Technology | 5621 |
| 免疫印迹 | ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 4695 |
| 磷酸化ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 5726 | |
| MEK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 4694 | |
| 磷酸化MEK1抗体 | Cell Signaling Technology | 9154 | |
| TRIM15抗体 | Proteintech | 13623-1-AP | |
| CYLD抗体 | Proteintech | 11110-1-AP | |
| 免疫沉淀 | ERK1/2偶联Sepharose珠 | Cell Signaling Technology | 5736 |
| Flag（M2）珠 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 药物处理 | MG132蛋白酶体抑制剂 | Sigma-Aldrich | -- |
| 细胞刺激 | 胰岛素样生长因子1 | Sigma-Aldrich | I3769 |
| 表皮生长因子 | Alomone Labs | E-100 | |
| 药物处理 | 维莫非尼 | Selleckchem | -- |
| 维莫非尼 | AdooQ | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Corning | -- |
| RPMI 1640培养基 | Corning | -- | |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen Life Technologies | -- | |
| 体外泛素化 | 泛素激活酶E1 | Boston Biochem | -- |
| 泛素结合酶UbcH13/Uev1a | Boston Biochem | -- | |
| 体外去泛素化 | 二泛素 | Enzo | BML-UW0775-0100 |
| 体外激酶实验 | GST-ELK-1融合蛋白（307–428氨基酸） | -- | -- |
| ELISA | 磷酸化ERK1/2 ELISA试剂盒 | JKBio | JLCa3420 |
| 双荧光素酶报告基因实验 | 双荧光素酶报告基因检测试剂盒 | Promega | E-1910 |
| 动物实验 | 基质胶 | BD Biosciences | -- |
| 免疫组化 | 双重染色聚合物试剂盒 | Vector Laboratories | MP-7724 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 配体刺激下ERK K63泛素化检测 | IGF1 100 ng/ml、EGF 50 ng/ml处理4 h；血清饥饿条件；SK-MEL-28、HEK293T、A549细胞 阅读提示：Fig. 1a–c图注及Methods中In vivo ubiquitination assay |
| TRIM15介导的ERK泛素化与位点鉴定 | K168R/K302R（ERK1）与K149R/K283R（ERK2）突变；泛素K63R/K48R；MG132 10 μM 阅读提示：Fig. 1d–h、Fig. 2f–i图注及Extended Data Fig. 3、4 |
| 体外泛素化与激酶实验 | E1 100 nM、UbcH13/Uev1a 1 μM、His-ubiquitin 100 μM、Flag-TRIM15 2 μM、ATP 10 mM；37 °C 60 min 阅读提示：Methods中In vitro ubiquitination assay与In vitro kinase assay |
| CYLD去泛素化实验 | CYLDCA（C601A）催化失活突变；体外去泛素化37 °C 1 h；Cyld+/+与Cyld−/− MEFs 阅读提示：Fig. 5d、5g–h图注及Methods中In vitro deubiquitination assay |
| 小鼠异种移植与PLX4032给药 | A375 1×10^6细胞皮下接种；PLX4032 20 mg/Kg每日腹腔注射；n=5/组；WM3960 4×10^6细胞、n=6 阅读提示：Methods中In vivo experiments and drug administration及Fig. 7i–q图注 |
| 患者标本免疫组化 | 48例黑色素瘤组织芯片；TRIM15 1:100、CYLD 1:50、p-ERK1/2 1:200抗体稀释；染色强度与范围评分相乘 阅读提示：Methods中Immunohistochemistry及Fig. 8a–c图注 |