外泌体分离与表征
从不同细胞系中分离外泌体并验证其典型特征
从14种细胞系的无血清培养基中通过超速离心分离外泌体,使用NTA和TEM分析大小和形态,流式检测CD9、CD63、CD81。
Quantitative proteomics identifies the core proteome of exosomes with syntenin-1 as the highest abundant protein and a putative universal biomarker.
14种细胞系外泌体Super-SILAC定量蛋白质组学,3种分离方法验证,多种物种和生物流体样本验证,Western blot和流式验证
14种人细胞系来源的外泌体 3种人细胞系(HEK293T、MDAMB231、PANC-1)不同分离方法的外泌体 小鼠、牛、马、山羊血清来源的外泌体 人血浆和尿液来源的外泌体
14种细胞系的外泌体分离和Super-SILAC定量,每种细胞系3个生物学重复 3种分离方法(DG、SEC、UC)对3种细胞系外泌体的蛋白质组比较 Syntenin-1在14种细胞系外泌体中的富集倍数(至少16倍)及Western blot验证 Syntenin-1在不同物种血清来源外泌体中的Western blot检测 Syntenin-1在100例人血浆和5例尿液外泌体中的Western blot检测
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
从不同细胞系中分离外泌体并验证其典型特征
从14种细胞系的无血清培养基中通过超速离心分离外泌体,使用NTA和TEM分析大小和形态,流式检测CD9、CD63、CD81。
无偏定量外泌体蛋白质组,鉴定普遍存在的核心蛋白质
将14种细胞系来源的外泌体与Super-SILAC重标标准混合,进行nLC-MS/MS分析,定量蛋白质。
验证核心蛋白质组的普遍性,筛选候选生物标志物和排除标志物
使用DG和SEC方法分离外泌体,与UC方法比较,验证1,212种核心蛋白质;基于丰度筛选候选标志物。
验证Syntenin-1在不同细胞来源、物种和生物流体外泌体中的普遍性和丰度
通过Western blot和流式细胞术检测Syntenin-1在14种细胞系、不同物种血清和人类血浆/尿液外泌体中的表达。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 外泌体分离与表征 | 细胞系来源和培养条件;无血清饥饿时间(48小时,HEK293T 24小时,Raji 16小时);超速离心参数(100,000×g,3小时,4°C) 阅读提示:Methods: Cell culture, Exosomes production, Cell line-derived exosomes isolation |
| Super-SILAC定量蛋白质组学 | Super-SILAC标准组成(8种SILAC标记细胞系);外泌体与标准混合比例(1:1);质谱参数(Q-Exactive HF或Orbitrap Lumos);生物学重复数(3次) 阅读提示:Methods: Sample preparation for mass spectrometry, nLC-MS/MS, MS data processing |
| 核心蛋白质组验证与生物标志物筛选 | 验证用细胞系(HEK293T、MDAMB231、PANC-1);分离方法(DG、SEC、UC);SILAC ratio阈值(log2 >0.2为富集,< -0.2为缺失);生物学重复数(3次) 阅读提示:Methods: Cell line-derived exosomes isolation, Proteomics data analysis; Results: Validation of the core proteome of exosomes using different isolation methods |
| Syntenin-1验证 | Syntenin-1抗体货号和稀释比例(Abcam #ab133267, 1:500-1:2000);样本类型(14种细胞系、不同物种血清、人血浆和尿液);检测方法(Western blot、流式细胞术) 阅读提示:Methods: Western blot, Flow cytometry of beads-bound exosomes, Analysis of exosomes by single particle flow cytometry |