定量蛋白质组学鉴定外泌体核心蛋白质组,其中Syntenin-1是丰度最高的蛋白质和推定的通用生物标志物

Quantitative proteomics identifies the core proteome of exosomes with syntenin-1 as the highest abundant protein and a putative universal biomarker.

作者信息Fernanda G Kugeratski, Kelly Hodge, Sergio Lilla, Kathleen M McAndrews, Xunian Zhou, Rosa F Hwang, Sara Zanivan, Raghu Kalluri
PMID34108659
发布时间2021-06
DOI10.1038/s41556-021-00693-y

实验完整度

高

14种细胞系外泌体Super-SILAC定量蛋白质组学,3种分离方法验证,多种物种和生物流体样本验证,Western blot和流式验证

主要模型

14种人细胞系来源的外泌体 3种人细胞系(HEK293T、MDAMB231、PANC-1)不同分离方法的外泌体 小鼠、牛、马、山羊血清来源的外泌体 人血浆和尿液来源的外泌体

重点核对

14种细胞系的外泌体分离和Super-SILAC定量,每种细胞系3个生物学重复 3种分离方法(DG、SEC、UC)对3种细胞系外泌体的蛋白质组比较 Syntenin-1在14种细胞系外泌体中的富集倍数(至少16倍)及Western blot验证 Syntenin-1在不同物种血清来源外泌体中的Western blot检测 Syntenin-1在100例人血浆和5例尿液外泌体中的Western blot检测

摘要

外泌体是来源于内体腔室的细胞外囊泡,可能参与细胞间通讯。我们发现常用的外泌体生物标志物具有异质性,在不同细胞类型中并不具有普遍适用性。为了揭示可作为外泌体生物标志物的普遍且丰富的蛋白质,我们采用基于Super-SILAC结合高分辨率质谱的无偏定量蛋白质组学方法。总共,无论细胞来源或分离方法如何,在外泌体蛋白质组中一致定量到1,212种蛋白质。与细胞相比,外泌体蛋白质组中有22种蛋白质普遍富集,15种蛋白质一致缺失。在富集的蛋白质中,我们鉴定了生物发生相关蛋白、GTP酶和膜蛋白,例如CD47和ITGB1。外泌体中缺失的蛋白质群主要由核蛋白组成。我们鉴定出Syntenin-1是不同细胞来源的外泌体中一致丰度最高的蛋白质,它也存在于不同物种和生物流体的外泌体中,具有作为外泌体推定通用生物标志物候选物的潜在效用。我们的研究提供了外泌体普遍存在的核心蛋白质的综合定量图谱,可作为致力于外泌体研究的科学界的资源。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
常用的外泌体生物标志物是否具有普遍性?能否发现普遍丰富的外泌体蛋白质作为通用生物标志物?
核心机制
外泌体核心蛋白质组包含生物发生相关蛋白(如Syntenin-1、Alix、TSG101)、GTP酶和膜蛋白(如CD47、ITGB1),这些蛋白可能参与外泌体生物发生、循环中的生物利用度或靶向机制;而核蛋白等在外泌体中缺失。
主要证据
通过Super-SILAC定量蛋白质组学在14种细胞系外泌体中鉴定出1,212种普遍存在的蛋白质,其中22种普遍富集,15种一致缺失;Syntenin-1被鉴定为最丰富且一致富集的蛋白质,并在不同物种和生物流体来源的外泌体中验证。
研究意义
提供了外泌体核心蛋白质组的综合定量图谱,可作为外泌体研究界的资源;Syntenin-1作为外泌体通用生物标志物的候选,可能有助于外泌体的鉴定、分离和功能研究。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

外泌体分离与表征

从不同细胞系中分离外泌体并验证其典型特征

从14种细胞系的无血清培养基中通过超速离心分离外泌体,使用NTA和TEM分析大小和形态,流式检测CD9、CD63、CD81。

2

Super-SILAC定量蛋白质组学分析

无偏定量外泌体蛋白质组,鉴定普遍存在的核心蛋白质

将14种细胞系来源的外泌体与Super-SILAC重标标准混合,进行nLC-MS/MS分析,定量蛋白质。

3

核心蛋白质组验证及生物标志物筛选

验证核心蛋白质组的普遍性,筛选候选生物标志物和排除标志物

使用DG和SEC方法分离外泌体,与UC方法比较,验证1,212种核心蛋白质;基于丰度筛选候选标志物。

4

Syntenin-1作为通用生物标志物的验证

验证Syntenin-1在不同细胞来源、物种和生物流体外泌体中的普遍性和丰度

通过Western blot和流式细胞术检测Syntenin-1在14种细胞系、不同物种血清和人类血浆/尿液外泌体中的表达。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
DMEM培养基Corning--
RPMI 1640培养基Corning--
DMEM:F12培养基Corning--
Defined Keratinocyte-SFM培养基Gibco--
胎牛血清----
青霉素-链霉素----
SILAC用DMEM培养基Thermo Scientific--
SILAC用RPMI 1640培养基Thermo Scientific--
透析胎牛血清Sigma--
Arg10Cambridge isotopesCNLM-539-H
Lys8Cambridge isotopesCNLM-291-H
APC Annexin V凋亡检测试剂盒(含7-AAD)BioLegend--
OptiPrep密度梯度介质Sigma--
qEV原始尺寸排阻柱35 nmIzonSP5
Amicon Ultra-2离心过滤单元MilliporeUFC201024
NanoSight LM10纳米颗粒跟踪分析仪Malvern--
JEM 1010透射电子显微镜JEOL--
formvar包被铜网----
醋酸铀Millipore--
醛/硫酸盐微球InvitrogenA37304
固定/透化试剂eBioscience00-5123-43, 00-5223-56
1×透化缓冲液eBioscience00-8333-56
IgG1κ同型对照BD555746
CD9抗体SigmaSAB4700092
CD63抗体BD556019
CD81抗体BD555675
CD47 [B6H12]抗体eBioscience14-0479-82
Alexa Fluor 488驴抗小鼠InvitrogenA21202
Alexa Fluor 647驴抗小鼠InvitrogenA31571
Alexa Fluor 647标记的Syntenin [EPR8102]抗体Abcamab205772
Alexa Fluor 647标记的同型对照兔IgG [EPR25A]Abcamab199093
APC标记的ITGB1/CD29 [TS2/16]抗体BioLegend303007
APC标记的小鼠IgG1 k同型对照 [MOPC-21]BioLegend400120
Alexa Fluor 647标记的抗人CD63抗体BioLegend353016
Alexa Fluor 647标记的小鼠IgG1k同型对照BioLegend400130
Alexa Fluor® 647 CD47抗体BD561249
Alexa Fluor® 647小鼠IgG1 κ同型对照BD557714
Alexa Fluor® 647抗人CD29抗体,克隆TS2/16BioLegend303018
Alexa Fluor® 647小鼠IgG1, κ同型对照(FC)抗体BioLegend400130
外泌体分离试剂Invitrogen4478359
Amicon Ultra-0.5离心过滤单元--UFC501024
RNeasy试剂盒Qiagen--
High-Capacity cDNA逆转录试剂盒(含RNase抑制剂)Life technologies4374966
Power SYBR green PCR预混液Applied Biosystems--
Wes系统Protein Simple--
EZ标准品包Protein SimplePS-ST01EZ-8
抗兔检测模块Protein SimpleDM-001
抗小鼠检测模块Protein SimpleDM-002
12–230 kDa Wes分离模块Protein SimpleW004-1
Flotillin-1抗体InvitrogenPA5-19713
Syntenin [EPR8102]抗体Abcamab133267
整合素β1 [D2E5]抗体CST9699
LGALS3BP [EPR21757-33]抗体Abcamab217572
Alix [3A9]抗体CST2171
TSG101 [4A10]抗体Abcamab83
SLC3A2/4F2hc/CD98 [D6O3P]抗体CST13180
CD47 [D3O7P]抗体CST63000
多物种Syntenin抗体AbcamAb19903
β-肌动蛋白(13E5)抗体CST4970
HRP标记的抗兔二抗CST7074
HRP标记的抗小鼠二抗R&DHAF007
West-Q Pico ECL溶液Gendepot--
ECL化学发光底物Pierce--
Amersham Hyperfilm胶片GE Healthcare--
microBCA蛋白质测定试剂盒Thermo Scientific--
二硫苏糖醇Sigma--
碳酸氢铵Sigma--
质谱级胰蛋白酶/LysC混合液Promega--
Pierce C18离心柱Thermo Scientific--
Q-Exactive HF质谱仪Thermo Scientific--
Orbitrap Lumos混合质谱仪Thermo Scientific--
EASY-nLC II 1200色谱系统Thermo Scientific--
ReproSIL-Pur C18-AQ, 1.9μm树脂----
主动背景离子减少装置(ABIRD)ESI Source Solutions--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
外泌体分离与表征
细胞系来源和培养条件;无血清饥饿时间(48小时,HEK293T 24小时,Raji 16小时);超速离心参数(100,000×g,3小时,4°C)
阅读提示:Methods: Cell culture, Exosomes production, Cell line-derived exosomes isolation
Super-SILAC定量蛋白质组学
Super-SILAC标准组成(8种SILAC标记细胞系);外泌体与标准混合比例(1:1);质谱参数(Q-Exactive HF或Orbitrap Lumos);生物学重复数(3次)
阅读提示:Methods: Sample preparation for mass spectrometry, nLC-MS/MS, MS data processing
核心蛋白质组验证与生物标志物筛选
验证用细胞系(HEK293T、MDAMB231、PANC-1);分离方法(DG、SEC、UC);SILAC ratio阈值(log2 >0.2为富集,< -0.2为缺失);生物学重复数(3次)
阅读提示:Methods: Cell line-derived exosomes isolation, Proteomics data analysis; Results: Validation of the core proteome of exosomes using different isolation methods
Syntenin-1验证
Syntenin-1抗体货号和稀释比例(Abcam #ab133267, 1:500-1:2000);样本类型(14种细胞系、不同物种血清、人血浆和尿液);检测方法(Western blot、流式细胞术)
阅读提示:Methods: Western blot, Flow cytometry of beads-bound exosomes, Analysis of exosomes by single particle flow cytometry