建立3D上皮类器官培养体系
获得具有完整顶端-基底极性的上皮类器官，用于研究极性对EMT的影响。
分离小鼠原代乳腺上皮类器官（MEOs）和培养人Caco2 3D类器官，通过免疫荧光检测极性标志物（F-actin、Par3、PKCζ等）确认极性形成。
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顶端-基底极性通过PAR复合物介导的SNAI1降解抑制上皮-间质转化和肿瘤转移
Apical-basal polarity inhibits epithelial-mesenchymal transition and tumour metastasis by PAR-complex-mediated SNAI1 degradation.
实验完整度
高包含小鼠和人类3D类器官、体外激酶实验、异种移植小鼠模型及人类乳腺癌组织芯片等多层级证据，并有功能与机制验证
主要模型
小鼠原代乳腺上皮类器官（MEOs） 人Caco2肠道上皮3D类器官 Caco2细胞皮下异种移植裸鼠模型 人乳腺癌组织芯片（TMA）队列
重点核对
TetON-SNAI1 MEOs中多西环素诱导SNAI1表达及EMT表型（E-cadherin、Fibronectin、Laminin V免疫荧光） Caco2 3D类器官中PAR3敲低或PZ09处理对SNAI1蛋白稳定性、S249磷酸化和泛素化的影响 Caco2异种移植模型中PAR3敲低和SNAI1敲低对肿瘤侵袭、循环肿瘤细胞和肺转移的影响 人乳腺癌组织芯片中PAR3和SNAI1蛋白表达的负相关性
摘要
顶端-基底极性的丧失和上皮-间质转化（EMT）的激活均促进癌进展和转移。在此，我们报道顶端-基底极性通过抑制EMT来抑制转移扩散。利用小鼠和人上皮3D类器官培养，我们发现PAR/非典型蛋白激酶C（aPKC）极性复合物通过促进SNAIL家族蛋白SNAI1的降解来抑制EMT和侵袭。在完整的顶端-基底极性下，aPKC激酶磷酸化SNAI1的S249位点，导致蛋白降解。顶端-基底极性的丧失阻止aPKC介导的SNAI1磷酸化并稳定SNAI1蛋白，从而促进EMT和侵袭。在人乳腺肿瘤异种移植中，抑制PAR复合物介导的SNAI1降解机制促进肿瘤侵袭和转移。对人乳腺组织样本的分析揭示PAR3和SNAI1蛋白水平呈负相关。我们的结果表明，顶端-基底极性作为EMT的关键检查点，在肿瘤转移过程中精确控制上皮-间质可塑性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 顶端-基底极性是否以及如何直接影响EMT转录因子SNAI1，从而调控肿瘤侵袭和转移。
- 核心机制
- 在完整的顶端-基底极性下，PAR复合物中的aPKC激酶磷酸化SNAI1的S249位点，促进其泛素化和蛋白酶体降解；极性丧失则稳定SNAI1，诱导EMT和侵袭。
- 主要证据
- 小鼠和人类3D类器官实验显示SNAI1蛋白在极性完整的类器官中不稳定；aPKC抑制剂PZ09或PAR3敲低增加SNAI1蛋白稳定性并诱导EMT；Caco2异种移植模型中PAR3敲低促进转移，而SNAI1敲低可逆转；人类乳腺癌组织芯片显示PAR3与SNAI1蛋白水平负相关。
- 研究意义
- 揭示顶端-基底极性作为EMT的关键检查点，通过PAR/aPKC-SNAI1轴精确控制上皮-间质可塑性，为理解肿瘤转移机制提供新视角。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测SNAI1在极性类器官中的蛋白稳定性
验证顶端-基底极性是否影响SNAI1蛋白稳定性及其诱导EMT的能力。
在TetON-SNAI1 MEOs中多西环素诱导SNAI1表达，比较2D和3D培养下SNAI1 mRNA和蛋白水平、半衰期及EMT标志物；使用放线菌酮（CHX）和MG132处理检测蛋白降解途径。
验证aPKC对SNAI1 S249的磷酸化及降解机制
确定aPKC激酶是否直接磷酸化SNAI1 S249并促进其泛素化降解。
进行体外激酶实验，使用纯化PKCζ和SNAI1 WT或S249A突变体，检测S249磷酸化；在293T细胞中共表达SNAI1、aPKC和β-TrCP，检测泛素化；在MCF10A细胞中表达SNAI1 WT、S249A、S249E突变体，检测蛋白稳定性和泛素化。
在3D类器官中验证PAR3/aPKC对SNAI1的调控
确认PAR复合物组分PAR3和aPKC在极性类器官中对SNAI1稳定性和EMT的调控作用。
在TetON-SNAI1 MEOs中使用PZ09抑制aPKC或shRNA敲低Par3，检测SNAI1蛋白水平、EMT标志物和侵袭；在Caco2类器官中敲低PAR3或使用PZ09，检测内源性SNAI1磷酸化、泛素化、半衰期和EMT。
体内验证PAR3-SNAI1轴对肿瘤侵袭和转移的影响
在动物模型中验证PAR3介导的SNAI1降解对肿瘤侵袭和转移的功能重要性。
将表达shControl、shPAR3或shPAR3+shSNAI1的GFP标记Caco2细胞皮下注射到裸鼠，6周后分析原发肿瘤、循环肿瘤细胞（CTCs）和肺转移。
分析人乳腺癌组织中PAR3和SNAI1表达相关性
探究PAR3-SNAI1调控机制是否与人乳腺癌进展相关。
对人乳腺癌组织芯片（TMA）进行PAR3和SNAI1免疫组化/免疫荧光染色，分析表达相关性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫染色 | SNAI1抗体 | CST | 3879 |
| 小鼠抗SNAI1 EC3单克隆抗体 | -- | -- | |
| Twist1抗体 | Santa Cruz | sc-81417 | |
| E-cadherin抗体 | BD | 610182 | |
| 纤连蛋白抗体 | Sigma | F3648 | |
| 整合素α5抗体 | Millipore | AB1928 | |
| 层粘连蛋白V抗体 | -- | -- | |
| 免疫染色和免疫印迹 | PAR3抗体 | Millipore | 07-330 |
| 磷酸化PKCζ (T560)抗体 | Abcam | ab62372 | |
| 免疫染色 | 波形蛋白抗体V9 | Santa Cruz | sc-6260 |
| 免疫印迹 | β-TrCP抗体 | Santa Cruz | sc-390629, sc-166492 |
| PKCι抗体 | Genetex | GTX102900 | |
| 免疫染色 | 细胞角蛋白8抗体 | DSHB | TROMA-I |
| 细胞角蛋白5抗体 | Covance | PRB-160P | |
| 免疫染色和免疫印迹 | aPKC抗体 | Santa Cruz | sc-216 |
| 免疫染色 | CD45抗体 | BD | 550539 |
| 泛细胞角蛋白抗体 | Abcam | ab9377 | |
| 免疫印迹 | 磷酸化SNAI1(S249)兔多克隆抗体 | Abgent | -- |
| GAPDH抗体 | Genetex | GTX100118 | |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 488、546和647偶联二抗 | Life Technologies | -- |
| 免疫印迹 | HRP偶联抗小鼠和抗兔二抗 | Jackson Immunoresearch | -- |
| 药物处理 | 多西环素 | Sigma | -- |
| ML7 | Sigma | -- | |
| PZ09 | Reagency | -- | |
| 细胞培养 | 基质胶（生长因子减少型） | BD Biosciences | -- |
| 胶原酶A | Roche | -- | |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒 | Sigma | -- | |
| 神经调节蛋白 | R&D system | -- | |
| 人表皮生长因子 | -- | -- | |
| 氢化可的松 | -- | -- | |
| 霍乱毒素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 硫酸鱼精蛋白 | -- | -- | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 杀稻瘟菌素 | -- | -- | |
| 免疫沉淀 | 蛋白G磁珠 | Invitrogen | -- |
| 二琥珀酰亚胺辛二酸酯 | Thermo Scientific Pierce | -- | |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| cDNA合成 | cDNA逆转录试剂盒 | Applied Biosystems | -- |
| qPCR | 7500 Fast实时PCR检测系统 | Applied Biosystems | -- |
| CFX Connect实时PCR检测系统 | Bio-Rad | -- | |
| 体外激酶实验 | 镍-氮川三乙酸琼脂糖树脂 | -- | -- |
| 细胞培养 | Sf-900 II SFM培养基 | Gibco | -- |
| 免疫荧光 | 含DAPI的封片剂 | Vector | -- |
| 细胞培养 | 细胞回收溶液 | Corning | -- |
| 免疫印迹 | RIPA缓冲液 | -- | -- |
| 免疫沉淀 | 免疫沉淀裂解缓冲液 | -- | -- |
| CTC分离 | CD45磁珠 | Invitrogen | -- |
| 组织芯片 | 组织芯片 | US Biomax Inc | BB08015, BR246a, T087b |
| Stage-2组织芯片 | National Cancer Institute Cancer Diagnosis Program | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 3D类器官培养 | MEOs培养条件：Matrigel浓度50%，培养基含1% ITS、25ng/ml EGF、50ng/ml NRG；Caco2培养：2% Matrigel，MEM含20% FBS 阅读提示：Methods: Isolation and 3D cultures of primary mammary epithelial organoids; Three-dimensional (3D) cell culture |
| SNAI1诱导和EMT检测 | 多西环素浓度1μg/ml，处理4天；EMT判定标准：E-cadherin连接减少、Laminin V丢失、Fibronectin增加 阅读提示：Methods: Inducible SNAI1 and TWIST1 transgenic mice; Figure legends 1b, 2c |
| 蛋白稳定性实验 | CHX浓度10μM，MG132浓度10μM处理4小时；时间点设置 阅读提示：Figure legends 1f, 1g, 3d, 3e, 6b, 7c |
| aPKC抑制 | PZ09浓度：体外激酶实验20μM，细胞实验5μM（FRET），MEOs和Caco2类器官中浓度未明确说明 阅读提示：Methods: In vitro kinase assay; aPKC kinase activity FRET Imaging; Figure legends 3h, 3i, 4f, 7b |
| 异种移植实验 | 细胞接种数量：shControl 5.0×10^6，shPAR3 0.5×10^6，shPAR3+shSNAI1 1.0×10^6；小鼠品系7周龄雌性BALB/c裸鼠；观察时间6周 阅读提示：Methods: Caco2 xenograft mouse model; Figure legend 8a |