UPR激活对昼夜节律振荡的影响
验证UPR激活是否影响昼夜节律振荡
用地塞米松同步U2OS Bmal1::Luc细胞，使用Tg处理，通过LumiCycle监测Bmal1启动子活性；用PERK抑制剂GSK2606414或PERK敲除MEFs验证PERK依赖性。
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PERK-miR-211轴抑制昼夜节律调节因子和蛋白质合成以促进癌细胞存活
A PERK-miR-211 axis suppresses circadian regulators and protein synthesis to promote cancer cell survival.
实验完整度
高包含细胞系、小鼠模型和患者样本，并有功能验证和机制验证
主要模型
U2OS骨肉瘤细胞系 Burkitt淋巴瘤细胞系（Raji、Ramos、CA46） PERK条件性敲除小鼠 c-myc驱动小鼠淋巴瘤模型
重点核对
U2OS Bmal1::Luc细胞经地塞米松同步后，Tg处理及GSK2606414预处理
摘要
未折叠蛋白反应（UPR）是一种应激激活的信号通路，调节细胞增殖、代谢和存活。昼夜节律钟协调代谢和信号转导与光/暗周期。我们探索了UPR信号如何与昼夜节律钟相互作用。UPR激活通过诱导miR-211引起昼夜节律振荡的10小时相位移动；miR-211是一种PERK诱导的microRNA，瞬时抑制Bmal1和Clock这两个核心昼夜节律调节因子。分子研究表明，miR-211通过不同机制直接调节Bmal1和Clock。虽然抑制Bmal1和Clock对特定昼夜节律基因的表达具有预期影响，但我们发现Bmal1的抑制对于UPR依赖的蛋白质合成抑制和细胞对破坏内质网稳态的应激的适应也至关重要。我们的数据表明，c-myc依赖的UPR激活在Burkitt淋巴瘤中抑制Bmal1，从而抑制昼夜节律振荡和持续的蛋白质合成，以促进肿瘤进展。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- UPR信号如何与昼夜节律钟相互作用？
- 核心机制
- PERK-eIF2α-ATF4通路诱导miR-211，miR-211通过靶向Clock 3'UTR和Bmal1启动子/5'UTR分别抑制Clock和Bmal1表达。
- 主要证据
- 体外U2OS细胞、PERK敲除MEFs、体内小鼠肝脏、Burkitt淋巴瘤细胞系及小鼠肿瘤模型显示UPR激活以PERK依赖方式抑制Bmal1和Clock，miR-211抑制剂可恢复其表达和振荡。
- 研究意义
- 揭示UPR与昼夜节律钟的交叉对话，PERK-miR-211介导的Bmal1抑制对于应激下蛋白质合成抑制和肿瘤细胞存活至关重要。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
miR-211对Bmal1和Clock的调控
验证miR-211是否介导UPR对Bmal1和Clock的抑制
在U2OS细胞中转染miR-211或anti-miR-211（A211），用Tg处理，检测Bmal1和Clock蛋白及mRNA水平；使用Dicer敲除MEFs验证miRNA依赖性。
miR-211直接靶向Clock 3'UTR和Bmal1启动子
验证miR-211是否直接结合Clock 3'UTR和Bmal1启动子/5'UTR
构建Clock 3'UTR野生型或miR-211种子序列突变型荧光素酶报告基因，以及Bmal1启动子野生型或突变型报告基因；进行生物素标记miR-211 pull-down、ChIP分析Ago、H3K27me3和RNA聚合酶II。
MYC通过UPR-miR-211抑制Bmal1和Clock
验证c-Myc是否通过PERK-miR-211轴抑制Bmal1和Clock
比较正常生发中心B细胞与Burkitt淋巴瘤细胞系中PERK活性、Bmal1/Clock表达和miR-211水平；在淋巴瘤细胞中抑制miR-211或PERK，检测Bmal1/Clock恢复及昼夜节律振荡。
Bmal1抑制对肿瘤细胞存活和蛋白质合成的影响
验证Bmal1抑制是否促进肿瘤细胞存活并抑制蛋白质合成
在U2OS细胞中过表达Bmal1，用Tg处理，检测凋亡、蛋白质合成（35S掺入）、4EBP1磷酸化和eIF4E/eIF4A结合；在CA46异种移植瘤模型中过表达Bmal1或A211，监测肿瘤生长；分析Bmal1表达与患者生存的关系。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证昼夜节律振荡
验证miRNA靶向机制
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | McCoy's 5a培养基 | Mediatech Inc | -- |
| 胎牛血清 | BenchMark | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| DMEM培养基 | Mediatech Inc | -- | |
| RPMI-1640培养基 | Mediatech Inc | -- | |
| 谷氨酰胺 | Gibco | -- | |
| β-巯基乙醇 | Gibco | -- | |
| MEM非必需氨基酸 | Gibco | -- | |
| 诱导N-myc | 4-羟基他莫昔芬 | Sigma | H7904 |
| 质粒构建 | In-Fusion克隆试剂盒 | Clontech | 011614 |
| Cold Fusion克隆试剂盒 | Clontech | 011614 | |
| 转染 | 脂质体转染试剂 | ThermoFisher Scientific | -- |
| 逆转录病毒感染 | 聚凝胺 | Millipore | TR-1003-G |
| 放射性标记 | EasyTag EXPRESS 35S | PerkinElmer | -- |
| 实时发光监测 | LumiCycle发光检测仪 | Actimetrics | -- |
| 甲虫荧光素 | -- | -- | |
| 生发中心B细胞分离 | 人B细胞分离试剂盒II | Miltenyi Biotec | 130-091-151 |
| 抗CD27-PE抗体 | Miltenyi Biotec | 130-097-926 | |
| 抗PE MultiSort微珠 | Miltenyi Biotec | -- | |
| LS分离柱 | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| 抗PE MultiSort试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-090-757 | |
| 抗CD10-生物素抗体 | Miltenyi Biotec | 130-114-691 | |
| 流式细胞分析 | APC Annexin V凋亡检测试剂盒 | BD Biosciences | -- |
| BD LSRFortessa流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| miRNA分析 | miRNeasy微型试剂盒 | Qiagen | -- |
| TaqMan逆转录试剂盒 | Applied biosystems | -- | |
| 动物实验 | 他莫昔芬 | Sigma-Aldrich | T5648 |
| 衣霉素 | -- | -- | |
| 克隆形成实验 | 吉姆萨染液 | -- | -- |
| 免疫组化 | Vectastain ABC Elite试剂盒 | Vector Laboratories | -- |
| 过氧化物酶底物DAB试剂盒 | Vector Laboratories | -- | |
| Ki-67抗体 | Abcam | ab15580 | |
| APO-BRDU-IHC (TUNEL)凋亡试剂盒 | Novus Biologicals | -- | |
| Western blot | Bmal1抗体 | Bethyl Laboratories Inc | A302-616A |
| Clock (D45B10)兔单抗 | Cell Signaling Technology | 5157 | |
| PERK (C33E10)兔单抗 | Cell Signaling Technology | 5683 | |
| Chop (L63F7)鼠单抗 | Cell Signaling Technology | 2895 | |
| ATF-4 (D4B8)兔单抗 | Cell Signaling Technology | 11815 | |
| 磷酸化eIF2α (Ser51) (119A11)兔单抗 | Cell Signaling Technology | 3597 | |
| 磷酸化4E-BP1 (Thr37/46) (236B4)兔单抗 | Cell Signaling Technology | 2855 | |
| eIF4E抗体 | Cell Signaling Technology | 9742 | |
| IRE1α (14C10)兔单抗 | Cell Signaling Technology | 3294 | |
| eIF4A (F52)抗体 | Cell Signaling Technology | 2425 | |
| S6核糖体蛋白 (5G10)兔单抗 | Cell Signaling Technology | 2217 | |
| 磷酸化p70 S6激酶 (Thr389) (1A5)鼠单抗 | Cell Signaling Technology | 9206 | |
| c-Myc抗体 | Cell Signaling Technology | 9402 | |
| BCL6 (D4I2V)兔单抗 | Cell Signaling Technology | 14895 | |
| eIF2α抗体 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| β-actin鼠单抗 (AC-74) | Sigma | 5316 | |
| qRT-PCR | iScript cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | -- |
| SsoAdvanced通用SYBR Green预混液 | Bio-Rad | -- | |
| ChIP | truChIP低细胞量染色质剪切试剂盒 | Covaris | -- |
| pan-Ago克隆2A8 | Millipore | MABE56 | |
| H3K27me3抗体 | Abcam | ab6002 | |
| H3K9me2抗体 | Abcam | ab1220 | |
| RNA聚合酶II抗体 | Abcam | ab817 | |
| Quick ChIP试剂盒 | Imgenex | -- | |
| m7GTP pull-down | m7GTP磁珠 | Creative Biolabs | -- |
| complete和PhosStop | Roche | -- | |
| Biotin-211 pull-down | 生物素标记miR-211双链 | Integrated DNA Technologies | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| UPR激活对昼夜节律振荡的影响 | Tg浓度（500 nM或0.5 μM）、GSK2606414浓度（1 μM）及预处理时间（1小时）、地塞米松同步浓度（0.1 μM） 阅读提示：Figure 1a和图例；Methods中Real-time luminescence monitoring |
| miR-211对Bmal1和Clock的调控 | miR-211/A211转染时间（48小时）、Tg处理浓度（500 nM）和时间（5小时） 阅读提示：Figure 3c和图例；Methods中miR-211和anti-miR-211转染及分析 |
| miR-211直接靶向Clock 3'UTR和Bmal1启动子 | 报告基因转染后检测时间（48小时）、Tg处理浓度（500 nM）和时间（5小时） 阅读提示：Figure 3f-g、Figure 4a-b和图例；Methods中质粒构建和转染 |
| MYC通过UPR-miR-211抑制Bmal1和Clock | 淋巴瘤细胞系转染效率及转染次数（两次）、PERK抑制剂GSK2606414浓度（1 μM） 阅读提示：Figure 5c-j和图例；Methods中miR-211和anti-miR-211转染及分析 |
| Bmal1抑制对肿瘤细胞存活和蛋白质合成的影响 | Tg浓度（500 nM或300 nM）、环己酰亚胺处理时间（3小时）、CA46细胞注射数量（1×10^6）、SCID小鼠每组5只、肿瘤体积测量频率（每2天） 阅读提示：Figure 7b、Figure 8a-e和图例；Methods中Clonogenic survival assay和Animal husbandry |