3D和2D共培养模型建立
观察CAFs是否引导癌细胞集体侵袭
将CAFs与A431细胞按比例混合形成球体，嵌入胶原/Matrigel进行3D侵袭，或在聚丙烯酰胺凝胶上进行2D迁移，追踪细胞轨迹和侵袭链。
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机械活跃的异型E-cadherin/N-cadherin黏附使成纤维细胞能够驱动癌细胞侵袭
A mechanically active heterotypic E-cadherin/N-cadherin adhesion enables fibroblasts to drive cancer cell invasion.
实验完整度
高包含体外2D/3D模型、磁力镊力学测量、基因敲除/敲低、体内成像和患者样本验证
主要模型
人外阴鳞状细胞癌CAFs与A431细胞共培养 人肺腺癌CAFs与H1437细胞共培养 患者来源鳞状细胞癌组织样本 小鼠耳部皮下共注射肿瘤模型
重点核对
A431细胞中E-cadherin敲除或CAFs中N-cadherin敲低对CAF引导侵袭的影响 磁力镊测量CAF与癌细胞间的力传递（~100 nN） E-cadherin/N-cadherin共定位及结合寿命（>60分钟） α-catenin/vinculin结合位点突变对机械传导和侵袭的影响 患者样本中E-cadherin/N-cadherin异型连接的免疫染色验证
摘要
癌症相关成纤维细胞（CAFs）促进肿瘤侵袭和转移。我们证明CAFs对癌细胞施加物理力，使其能够集体侵袭。力传递由涉及CAF膜上的N-cadherin和癌细胞膜上的E-cadherin的异亲性黏附介导。这种黏附具有机械活性；当受到力时，它触发β-catenin招募和依赖于α-catenin/vinculin相互作用的黏附增强。E-cadherin/N-cadherin黏附的损伤消除了CAFs引导集体细胞迁移的能力，并阻断了癌细胞侵袭。N-cadherin还介导CAFs远离癌细胞的重极化。同时，nectins和afadin被招募到癌细胞/CAF界面，CAF重极化依赖于afadin。在患者来源的材料中观察到CAFs和癌细胞之间的异型连接。总之，我们的发现表明，CAFs和癌细胞之间机械活跃的异亲性黏附使合作性肿瘤侵袭成为可能。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CAFs如何通过物理力驱动癌细胞的集体侵袭？
- 核心机制
- CAFs膜上的N-cadherin与癌细胞膜上的E-cadherin形成异亲性黏附，该黏附具有机械活性，受外力时通过α-catenin/vinculin招募增强黏附，并介导力传递和CAF重极化。
- 主要证据
- 体外2D和3D共培养模型显示CAFs引导癌细胞侵袭；磁力镊测量力传递约100 nN；E-cadherin敲除或N-cadherin敲低消除力传递和引导；α-catenin ΔVBS突变阻断机械传导；患者样本中观察到异型连接。
- 研究意义
- 揭示了CAFs和癌细胞之间机械活跃的异亲性黏附是合作性肿瘤侵袭的关键机制，提示靶向该相互作用可能干预保留上皮特征的癌症转移。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
力传递测量
验证CAFs是否对癌细胞施加拉力
使用牵引力显微镜测量CAF在接触前后的牵引力，计算传递到癌细胞的净力。
异型黏附分子鉴定
确定介导CAF-癌细胞黏附的分子
通过QRT-PCR、免疫荧光、SIM/STORM和TEM/FIB-SEM检测E-cadherin/N-cadherin共定位及连接超微结构。
机械敏感性和信号传导验证
检测异型黏附是否响应机械力并触发信号
磁力镊施加脉冲力，测量珠位移和黏附增强，免疫染色检测β-catenin和E-cadherin招募，使用α-catenin突变体。
功能丧失实验
验证异型黏附对癌细胞侵袭和CAF极化的必要性
在2D和3D模型中敲除E-cadherin或敲低N-cadherin/afadin，分析领导/跟随比例、逃逸角度和侵袭链数量。
体内和患者样本验证
确认异型连接在体内和患者组织中的存在
小鼠耳部共注射A431和CAFs进行活体成像，免疫染色患者鳞癌和肺腺癌样本。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 胰岛素-转铁蛋白-硒 | Invitrogen | 41400-045 |
| 转化生长因子β1 | R&D Systems | -- | |
| 稳定细胞系构建 | Xtremegene HP DNA转染试剂 | Roche | -- |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| ProFection哺乳动物转染系统-磷酸钙 | Promega | -- | |
| siRNA转染 | Lipofectamine RNAiMAX试剂 | Life Technologies | 13778-075 |
| Neon转染设备 | Invitrogen | -- | |
| QRT-PCR | Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG with Rox | Invitrogen | -- |
| 7900HT快速实时PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 3D侵袭实验 | 基质胶 | BD Bioscience | -- |
| I型胶原 | -- | -- | |
| 甲基纤维素 | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| 聚丙烯酰胺凝胶制备 | 绿色荧光羧基修饰微珠 | Invitrogen | F8811 |
| Sulfo-SANPAH | Thermo-Scientific | -- | |
| 纤连蛋白 | Sigma | F0895 | |
| 免疫染色 | 抗E-cadherin单克隆抗体（HECD-1） | Crick Institute hybridoma cell services | -- |
| 抗N-cadherin单克隆抗体（克隆014） | Sino Biological | 11039-H08H | |
| 抗N-cadherin单克隆抗体（克隆8C11） | Thermo Scientific | MA1-2002 | |
| 抗P-cadherin单克隆抗体（克隆6A9） | Upstate MerckMillipore | 05-916 | |
| 抗β-catenin单克隆抗体（克隆14） | BD Transduction Laboratories | 610153 | |
| 抗β-catenin多克隆抗体 | Thermo Scientific | 71-2700 | |
| 抗β-catenin单克隆抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc7963 | |
| 抗Cadherin-11单克隆抗体（CadherinOB，克隆16A） | Thermo scientific | MAI-06306 | |
| 封闭性抗E-cadherin单克隆抗体（DECMA-1） | Sigma | U3254 | |
| 抗Nectin3多克隆抗体（C-19） | Santa cruz biotechnology | sc-14806 | |
| 抗Nectin2单克隆抗体（克隆B-C12） | abcam | ab27344 | |
| 抗Afadin多克隆抗体（抗MLLT4） | Sigma | HPA030212 | |
| 抗α-catenin单克隆抗体（克隆15D9） | Enzo life science | ALX-804-101-C100 | |
| 抗Vinculin多克隆抗体（磷酸化Y821） | abcam | ab 61071 | |
| Alexa fluor 647鬼笔环肽 | Thermo fischer scientific | A22287 | |
| 抗活性β1整合素 | BD Pharmingen | 556048 | |
| 抗纤连蛋白 | SIGMA | F3648 | |
| 抗肌动蛋白 | SIGMA | a3853 | |
| 抗α平滑肌肌动蛋白 | SIGMA | A2547 | |
| Alexa Fluor 647抗兔 | Life Technology | A-21245 | |
| Alexa Fluor 488抗兔 | Life Technology | A-21206 | |
| Alexa Fluor 488抗鼠 | Life Technology | A-11029 | |
| Alexa Fluor 555抗鼠 | Life Technology | A-21424 | |
| Western blot | Laemmli 1X上样缓冲液 | Sigma | -- |
| β-巯基乙醇 | Biorad | -- | |
| 硝酸纤维素膜 | Whatman, GE Healthcare Life Sciences | -- | |
| 辣根过氧化物酶偶联二抗 | Jackson | 715-035-151 | |
| LumiLight试剂盒 | Roche | -- | |
| Luminata Classico | EMD Millipore | -- | |
| ImageQuant LAS4000成像系统 | GE Healthcare Life Sciences | -- | |
| 抗E-cadherin小鼠单克隆抗体（HECD-1） | Crick Institute hybridoma cell services | -- | |
| 抗P-cadherin兔多克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 2130 | |
| 抗β微管蛋白单克隆抗体 | Sigma | T7816 | |
| 磁力镊 | 羧基表面铁磁珠 | Spherotech | -- |
| E-cadherin-Fc融合蛋白 | Creative Biomart | CDH1-274H | |
| P-cadherin-Fc融合蛋白 | R&D Systems | 861-PC | |
| N-cadherin-Fc融合蛋白 | Creative Biomart | CDH2-315H | |
| 活体成像 | 倒置Zeiss LSM 780多光子激光扫描共聚焦显微镜 | Zeiss | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 3D侵袭实验 | 胶原I浓度约4 mg/ml，Matrigel浓度2 mg/ml，CAF与A431比例1:1，侵袭时间60小时 阅读提示：Methods '3D invasion assay' |
| 2D迁移实验 | 聚丙烯酰胺凝胶硬度6 kPa，A431球体贴附过夜，CAFs加入密度0.3×10^4细胞/孔 阅读提示：Methods '2D spheroid assay' 和 'Polyacrylamide gel preparation' |
| 磁力镊力传递测量 | 磁珠包被蛋白浓度32 μg/ml，脉冲力1 Hz、0.1 nN持续4分钟，或恒定力0.5 nN持续1分钟 阅读提示：Methods 'Magnetocytometry' |
| E-cadherin/N-cadherin结合寿命 | A431-EcadWT与CAF接触的共定位持续时间分类（<30, 30-60, >60分钟） 阅读提示：Figure 2h 和 Methods 'Measurement of heterotypic contact time' |
| 体内成像 | 小鼠耳部皮内注射3-5×10^5细胞（1:1 CAF/A431），注射后4天和7天成像 阅读提示：Methods 'Intravital imaging' |