TGF-β长期处理诱导EMT逆转和Dab2切割
观察长期TGF-β处理对EMT标志物和Dab2表达的影响
用TGF-β处理NMuMG细胞不同时间，免疫印迹检测N-cadherin、vimentin和Dab2；实时PCR检测Dab2 mRNA；在Eph4 Ras和HMLE细胞中验证。
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组织蛋白酶B介导的Disabled-2切割调控TGF-β诱导的自噬
Cathepsin-B-mediated cleavage of Disabled-2 regulates TGF-β-induced autophagy.
实验完整度
高包含体外细胞模型、多种突变体、体内移植瘤模型和患者组织样本，进行了功能验证和机制验证（蛋白切割、相互作用、磷酸化等）。
主要模型
NMuMG小鼠乳腺上皮细胞 Eph4 Ras小鼠乳腺上皮细胞 HMLE人乳腺上皮细胞 BT-20和MDA-MB-468人乳腺癌细胞系 SCID小鼠乳腺脂肪垫移植瘤模型
重点核对
TGF-β处理时间（3天、7天等）及浓度：文中未明确说明 CTSB抑制剂II和CA074Me浓度20 µM，处理6小时 DOXO浓度2.0 µg/ml处理24小时（流式）或用于克隆形成实验的浓度文中未明确说明 PYR-41浓度20 µM处理4小时 Apigenin浓度20 µM处理6小时
摘要
转化生长因子-β（TGF-β）诱导Disabled-2（Dab2）的表达，Dab2是一种内吞衔接蛋白和肿瘤抑制因子，同时伴随乳腺上皮细胞中上皮-间质转化（EMT）的诱导。在本研究中，我们展示在TGF-β介导的EMT之后，持续的TGF-β处理导致Dab2被组织蛋白酶B（CTSB）蛋白酶体降解，间质表型丧失并诱导自噬。抑制CTSB或表达抗CTSB切割的Dab2突变体可维持Dab2表达，并使长期TGF-β处理的细胞从自噬转向凋亡。我们进一步展示Dab2与Beclin-1相互作用，促进酪蛋白激酶2介导的Beclin-1磷酸化，阻止Beclin-1-Vps34相互作用及随后的自噬体组装。因此，CTSB介导的Dab2降解允许Beclin-1-Vps34诱导自噬，而持续的Dab2表达通过稳定促凋亡蛋白Bim阻止自噬并促进凋亡。体内研究表明Dab2介导的自噬调控调节化疗耐药性和肿瘤转移。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TGF-β长期处理如何调控Dab2表达及自噬与凋亡的转换？
- 核心机制
- CTSB切割Dab2解除Dab2对Beclin-1-Vps34相互作用的抑制，从而诱导自噬；Dab2通过促进CK2介导的Beclin-1磷酸化（Ser337/Ser341）阻止Beclin-1-Vps34结合，并稳定Bim促进凋亡。
- 主要证据
- 在NMuMG等细胞中，TGF-β长期处理导致Dab2被CTSB切割，LC3BII升高、p62降低；CTSB敲低或LVL Dab2突变体阻止自噬并增加凋亡；免疫共沉淀和体外激酶实验证实Dab2-Beclin-1-CK2相互作用及Beclin-1磷酸化；小鼠移植瘤实验显示Dab2增强DOXO疗效并抑制转移。
- 研究意义
- 揭示Dab2作为自噬抑制因子和凋亡促进因子，靶向该机制可能提供治疗益处，调节化疗耐药性和肿瘤转移。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定CTSB为Dab2切割酶
确定负责Dab2切割的蛋白酶
蛋白酶抑制剂筛选，体外切割实验使用[35S]标记的p96 Dab2与细胞提取物孵育，鉴定切割位点，构建LVL Dab2突变体。
验证CTSB对Dab2的切割及对自噬/凋亡的调控
验证CTSB介导的Dab2降解是否调控TGF-β诱导的自噬和凋亡
构建CTSB敲低、过表达和LVL Dab2表达的NMuMG细胞，TGF-β处理不同时间，免疫印迹检测自噬标志物（LC3BII、p62、Beclin-1）和凋亡标志物（Bim、cleaved caspase-3），并观察形态变化。
研究Dab2调控Beclin-1-Vps34和ERK-Bim相互作用的机制
阐明Dab2抑制自噬和促进凋亡的分子机制
免疫共沉淀分析Beclin-1与Vps34、ERK、Bim的相互作用，免疫荧光观察共定位，使用PYR-41抑制Bim泛素化降解，使用ERK抑制剂。
验证CK2介导的Beclin-1磷酸化在Dab2调控自噬中的作用
确定CK2磷酸化Beclin-1的位点及其对Beclin-1-Vps34相互作用的影响
体外激酶实验使用重组CK2和Beclin-1突变体（S64A、S337A、S341A），免疫共沉淀分析磷酸化模拟突变体（S337E、S341E）对相互作用的影响，使用CK2抑制剂apigenin，检测PtdIns3P水平。
评估Dab2对化疗药物敏感性的影响
研究Dab2调控的自噬对化疗细胞毒性的影响
在BT-20（高Dab2低CTSB）和MDA-MB-468（低Dab2高CTSB）细胞中敲低Dab2或过表达LVL Dab2，并敲低Beclin-1或表达muBeclin-1，用DOXO处理，进行克隆形成实验、流式细胞术检测自噬和凋亡。
体内验证Dab2对肿瘤生长、转移和化疗敏感性的影响
在动物模型中验证Dab2调控自噬对化疗耐药和转移的作用
将BT-20、MDA-MB-468及其衍生细胞注射到SCID小鼠乳腺脂肪垫，进行DOXO或紫杉醇治疗，监测肿瘤大小和重量，生物发光成像检测转移，Kaplan-Meier分析生存率，免疫组化检测Ki-67、TUNEL、p62等。
分析人乳腺癌组织中CTSB和Dab2表达
验证CTSB和Dab2表达与乳腺癌侵袭性的关系
对15例侵袭性和15例非侵袭性人乳腺癌组织进行免疫组化染色，检测CTSB和Dab2表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | GE Healthcare Life Sciences | SH30081.01 |
| Plasmid构建 | Myc标签CTSB表达构建体 | Sino Biological | -- |
| shRNA | 组织蛋白酶B shRNA | OriGene Technologies | -- |
| Dab2 shRNA | OriGene Technologies | -- | |
| psiRNA-Beclin-1构建体 | InvivoGen | -- | |
| 免疫印迹 | Dab2抗体 | BD Biosciences | 610464 |
| N-钙黏蛋白抗体 | BD Biosciences | 610920 | |
| 小鼠CTSB抗体 | Sigma | SAB1405676 | |
| 人CTSB抗体 | Abcam | ab125067 | |
| 波形蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 5741 | |
| LC3B抗体 | Cell Signaling Technology | 2775 | |
| Beclin-1抗体 | Cell Signaling Technology | 3738 | |
| p62抗体 | Cell Signaling Technology | 8025 | |
| Bim抗体 | Cell Signaling Technology | 2819 | |
| 磷酸化Bim抗体 | Cell Signaling Technology | 4581 | |
| ERK抗体 | Cell Signaling Technology | 9102 | |
| 磷酸化ERK抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| 切割型caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9661 | |
| Atg14抗体 | Cell Signaling Technology | 5504 | |
| Smad2抗体 | Cell Signaling Technology | 5339 | |
| 磷酸化Smad2抗体 | Cell Signaling Technology | 3108 | |
| 磷酸化Smad3抗体 | Cell Signaling Technology | 9520 | |
| 微管蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 2146 | |
| Vps34抗体 | Cell Signaling Technology | 3811 | |
| 组蛋白H3抗体 | Cell Signaling Technology | 4499 | |
| 体外激酶实验 | 重组CK2激酶 | New England Biolabs | -- |
| 免疫印迹 | CK2α抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-6479 |
| Smad3抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-101154 | |
| shRNA | Smad3 shRNA构建体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-38377-V |
| 免疫印迹 | 钠钾ATP酶α1抗体 | Novus | NB300-146 |
| 免疫荧光 | 抗Alexa488二抗 | Life Technologies | A11001 |
| 抗Alexa546二抗 | Life Technologies | A11036 | |
| 蛋白酶体抑制剂 | MG-132 | EMD Millipore | -- |
| E64 | EMD Millipore | -- | |
| CTSB抑制剂 | CTSB抑制剂II | EMD Millipore | -- |
| 蛋白酶体抑制剂 | 乳胞素 | EMD Millipore | -- |
| CTSB抑制剂 | CA074Me | Santa Cruz Biotechnology | -- |
| 蛋白酶体抑制剂 | 硼替佐米 | Santa Cruz Biotechnology | -- |
| ALLN | Santa Cruz Biotechnology | -- | |
| 细胞筛选 | 嘌呤霉素 | Sigma-Aldrich | -- |
| 新霉素 | InvivoGen | -- | |
| 潮霉素 | InvivoGen | -- | |
| 博来霉素 | InvivoGen | -- | |
| CK2抑制剂 | 芹菜素 | Cayman Chemical | -- |
| shRNA | Smad2 shRNA构建体 | Applied Biological Materials | i049389 |
| 定点突变 | 定点突变试剂盒 | Life Technologies | -- |
| RNA提取 | RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | 74104 |
| 逆转录 | SuperScript III第一链合成系统试剂盒 | Invitrogen | 18080-051 |
| 实时PCR | SYBR Green预混液 | Roche | 04913922001 |
| MyiQ5 ICycler | BioRad | -- | |
| 细胞侵袭实验 | 细胞侵袭实验试剂盒 | Cell Biolabs | -- |
| HAME-3染色试剂盒 | Fisher Scientifics | -- | |
| 透射电子显微镜 | JEOL JEM1010电子显微镜 | JEOL | -- |
| PtdIns3P检测 | PtdIns3P酶联免疫吸附测定试剂盒 | Echelon Biosciences | -- |
| MTT实验 | MTT | Sigma | -- |
| 动物实验 | 荧光素底物 | Caliper LifeSciences | -- |
| 动物成像 | IVIS200成像系统 | -- | -- |
| 转染 | Lipofectamine plus | ThermoFisher Scientific | 15338100 |
| 免疫荧光 | Leica TCS SP2共聚焦显微镜 | Leica Microsystems | -- |
| CTSB活性实验 | CTSB细胞裂解缓冲液 | BioVision | -- |
| CTSB底物Ac-RR-AFC | -- | -- | |
| 体外激酶实验 | T7-Quick偶联TNT系统 | Promega | -- |
| [γ-32P]ATP | PerkinElmer | -- | |
| 流式细胞术 | Cyto-ID绿色检测试剂 | Enzo Life Sciences | -- |
| Annexin V-FITC抗体 | Pharmingen | -- | |
| 碘化丙啶 | BD Pharmingen | -- | |
| FACS LSRII系统 | BD Biosciences | -- | |
| H&E染色 | 伊红 | Sigma-Aldrich | -- |
| 免疫组化 | 抗Ki-67抗体 | -- | -- |
| 抗p62抗体 | -- | -- | |
| 抗Dab2抗体 | -- | -- | |
| 抗Flag抗体 | -- | -- | |
| 抗CTSB抗体 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| TGF-β处理 | TGF-β浓度和溶剂：文中未明确说明；处理时间：3天、7天等 阅读提示：Methods中未提供，需参考图注或结果描述 |
| CTSB抑制剂处理 | 抑制剂II和CA074Me浓度20 µM，处理6小时 阅读提示：图1c图注 |
| DOXO处理 | DOXO浓度2.0 µg/ml处理24小时（流式）；克隆形成实验浓度文中未明确说明 阅读提示：图7c,d图注 |
| PYR-41处理 | 浓度20 µM，处理4小时 阅读提示：图4e图注 |
| Apigenin处理 | 浓度20 µM，处理6小时 阅读提示：图6c图注 |
| 动物实验 | 细胞数量2×10^5，每组10只SCID小鼠，DOXO或紫杉醇剂量8-10 mg/kg/周，治疗3-4周 阅读提示：Methods中Tumorigenesis assay部分 |