定量蛋白质组学筛选EMT诱导的膜蛋白
鉴定介导干细胞与基质细胞相互作用的细胞表面蛋白
对HMLE-vector和HMLE-Twist细胞进行SILAC标记，膜蛋白分离和质谱分析，比较EMT前后膜蛋白表达变化。
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- 移动端
由单核细胞和巨噬细胞通过邻分泌信号支持的乳腺癌干细胞微环境
A breast cancer stem cell niche supported by juxtacrine signalling from monocytes and macrophages.
实验完整度
高包含体外细胞模型、小鼠移植瘤模型、患者样本免疫荧光及定量蛋白质组学等多层级验证
主要模型
HMLE及其EMT衍生细胞系（HMLE-Twist/Snail/Slug/Ras） THP1单核细胞系及原代小鼠巨噬细胞/人单核细胞 NOD-SCID和Nude小鼠乳腺脂肪垫移植瘤模型 MMTV-PyMT自发乳腺癌小鼠模型 患者乳腺肿瘤组织样本
重点核对
CD90hiCD24−细胞在HMLER中的肿瘤起始能力比bulk细胞高60倍 shCD90敲低降低HMLER90hi细胞肿瘤生长 单核细胞与HMLER90hi细胞的粘附依赖CD90（敲低减少3倍） 巨噬细胞清除（氯膦酸盐脂质体）几乎完全阻断肿瘤起始 共注射TAMs使CD90+ CSCs肺转移效率提高22倍
摘要
被称为上皮-间质转化（EMT）的细胞生物学程序赋予癌细胞间质特征以及进入癌症干细胞（CSC）状态的能力。然而，CSCs与其周围微环境之间的相互作用尚不清楚。在此我们展示肿瘤相关单核细胞和巨噬细胞（TAMs）通过与CSCs的邻分泌信号建立CSC微环境。我们进行了定量蛋白质组学分析，发现EMT程序上调CD90/Thy1和EphA4的表达，它们通过直接结合TAMs上各自的对应受体介导CSCs与TAMs的物理相互作用。作为响应，癌细胞上的EphA4受体激活Src和NF-κB，后者导致CSCs分泌多种细胞因子；这些细胞因子用于维持干细胞状态。事实上，混合的巨噬细胞增强了癌细胞的CSC活性。这些发现强调了TAMs作为CSC微环境重要组成部分的意义。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 乳腺癌干细胞（CSCs）与肿瘤相关单核细胞/巨噬细胞（TAMs）之间是否存在直接相互作用，以及这种相互作用如何维持CSC状态？
- 核心机制
- EMT程序上调CD90和EphA4；CD90锚定单核/巨噬细胞，EphA4与单核细胞上的ephrin-A配体结合激活Src和NF-κB，NF-κB p50与Twist协同结合细胞因子启动子，诱导IL-6、IL-8和GM-CSF分泌，从而维持CSC干细胞状态。
- 主要证据
- 定量蛋白质组学鉴定CD90和EphA4上调；体外共培养显示CD90依赖的单核细胞粘附和EphA4依赖的细胞因子诱导；小鼠移植瘤实验证明TAMs促进肿瘤起始和转移，且依赖NF-κB；患者样本免疫荧光显示CD90+ CSCs与CD68+ TAMs邻接。
- 研究意义
- 揭示了TAMs作为CSC微环境重要组成部分的机制，提示CD90和Eph受体可能成为靶向CSCs的治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
CD90hi细胞群体的干细胞特性验证
验证CD90表达与乳腺干细胞/CSC状态的关联
流式分选CD90hiCD24−和CD90loCD24+细胞，进行乳腺球形成实验和极限稀释移植瘤实验。
CD90介导的单核细胞粘附实验
验证CD90作为单核细胞粘附锚定的功能
将RFP+ THP1单核细胞与GFP+ HMLER90hi或HMLER90lo单层细胞共培养，洗涤后定量粘附单核细胞。
TAMs与CSCs体内共定位及功能验证
验证TAMs与CSCs在肿瘤组织中的物理邻接及其对肿瘤生长的作用
免疫荧光染色xenograft肿瘤和患者组织检测CD90+ CSCs与F4/80+或CD68+ TAMs的邻接；通过氯膦酸盐脂质体清除巨噬细胞或共注射单核细胞/TAMs评估肿瘤起始和生长。
单核细胞刺激的细胞因子诱导及信号通路解析
解析CSC-TAM相互作用诱导细胞因子分泌的分子机制
共培养后qRT-PCR和ELISA检测IL-6、IL-8、GM-CSF；使用transwell分隔、CD90敲低、EphA4抑制剂KYL、shRNA敲低EphA4/PLCγ1/PKCδ、NF-κB超级抑制子等验证信号通路。
EphA4及下游信号在体内的功能验证
验证EphA4和NF-κB在TAMs促进肿瘤生长中的功能必要性
将shEphA4敲低或NF-κB超级抑制子表达的HMLER90hi细胞单独或与单核细胞/TAMs共注射，测量肿瘤重量；免疫荧光检测磷酸化PLCγ1。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | MEGM培养基 | Lonza | -- |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| RPMI1640培养基 | -- | -- | |
| 流式分析 | 抗CD90-APC抗体 | BD Biosciences | 559869 |
| 抗CD24-PE抗体 | BD Biosciences | 555428 | |
| 抗CD11b-PE抗体 | BD Biosciences | 557397 | |
| 抗Ly-6G-AlexaFlour700抗体 | BD Biosciences | 561236 | |
| 抗F4/80-PE-Cy7抗体 | EBiosciences | 25-4801-82 | |
| 抗CD14-PE-Cy7抗体 | EBiosciences | 25-0149-71 | |
| 抗CD11b-APC抗体 | EBiosciences | 17-0118-71 | |
| qRT-PCR | RNeasy Plus Mini试剂盒 | Qiagen | -- |
| High Capacity RNA-to-cDNA试剂盒 | Applied Biosystem | -- | |
| SYBR Green Mix I | Roche Diagnostics | -- | |
| LightCycler® 480系统 | Roche Diagnostics | -- | |
| ELISA | IL-6 ELISA试剂盒 | Ray Biotech | -- |
| GM-CSF ELISA试剂盒 | Ray Biotech | -- | |
| IL-8 ELISA试剂盒 | EBiosciences | -- | |
| Multiskan EX酶标仪 | Thermo Electron Corporation | -- | |
| 细胞增殖 | WST1试剂 | Roche | 11644807001 |
| 原代细胞分离 | Bio-Gel P-100 | Bio-Rad | 150-4174 |
| 抗PE磁珠 | Miltenyi Biotec | -- | |
| 人CD14磁珠 | Miltenyi Biotec | -- | |
| Western blot | NE-PER核质分离试剂盒 | Pierce | -- |
| Dc蛋白测定试剂 | Bio-Rad | -- | |
| 抗Twist抗体 | Abcam | ab50887 | |
| 对照IgG | CST | 5415 | |
| 抗p105/p50抗体 | CST | 3035 | |
| ChIP | 蛋白G磁珠 | Invitrogen | -- |
| PI-PLC处理 | 磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C | Invitrogen | P-6466 |
| 免疫荧光 | 兔抗磷酸化PLCγ1 (pY783)抗体 | Abcam | ab53125 |
| 兔抗 cleaved caspase 3抗体 | CST | 9664 | |
| 小鼠抗Ki67抗体 | BD Biosciences | 550609 | |
| 大鼠抗F4/80抗体 | Invitrogen | MF48000 | |
| 小鼠抗α-SMA抗体 | Sigma | -- | |
| 单克隆兔抗人CD90抗体 | Abcam | ab133350 | |
| 小鼠抗人CD68抗体 | Dako | M0876 | |
| 小鼠抗广谱细胞角蛋白-FITC [AE1/AE3] | eBioscience | 53-9003-80 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Prolong Gold抗淬灭封片剂 | Invitrogen | P36934 | |
| 质谱分析 | Agilent 3100 OFFGEL分级仪 | Agilent Technologies | -- |
| LTQ-Orbitrap质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| LTQ Orbitrap XL质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 共培养实验 | 单核细胞与单层细胞比例（3:2）、共培养时间（1小时至6小时）、洗涤次数（2次） 阅读提示：Methods中Coculture assays小节 |
| CD90hi细胞分选与乳腺球形成 | 分选标记（CD90和CD24）、接种细胞数、乳腺球计数时间（8-12天） 阅读提示：Methods中Fluorescence activated cell sorting和Mammosphere/tumorsphere culture小节；Figure 1c,d图注 |
| 小鼠移植瘤实验 | 细胞数量、注射部位（第四乳腺脂肪垫）、小鼠品系（NOD-SCID/Nude/Fvb）、Matrigel比例、观察时间 阅读提示：Methods中Animal experiments小节；Figure 2a、4a,b、6e、7d图注 |
| 巨噬细胞清除实验 | 氯膦酸盐脂质体剂量和注射方式、对照脂质体、小鼠品系（Nude） 阅读提示：Methods中Animal experiments小节；Figure 4a图注 |
| EphA4抑制剂处理 | KYL肽浓度、预处理时间（40分钟）、对照肽（KYL-P7A） 阅读提示：Methods中Coculture assays小节；Figure 6c,d图注 |
| NF-κB超级抑制子实验 | IκBα S32A/S36A表达载体、共注射细胞数量、肿瘤测量时间（7周） 阅读提示：Methods中Creation of stable cell lines和Animal experiments小节；Figure 7d图注 |