Wnt报告活性与β-catenin缺失对HFSC静息的影响
验证静息HFSCs是否响应Wnt信号以及β-catenin对维持静息状态的作用。
使用Axin2LacZ/+报告小鼠检测毛囊周期中Wnt活性；利用K15CrePGR;Ctnnb1fl/fl;Rosa26-YFP小鼠在第二个静息期通过RU486诱导β-catenin敲除，观察毛发再生和干细胞标志物表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
经典Wnt调控因子对毛囊干细胞的体内转录调控
In vivo transcriptional governance of hair follicle stem cells by canonical Wnt regulators.
实验完整度
高包含条件性基因敲除小鼠、过表达转基因小鼠、体内ChIP-seq、RNA-seq、移植实验及体外细胞功能验证等多层级证据。
主要模型
K15CrePGR介导的Ctnnb1条件性敲除小鼠毛囊干细胞 K15CrePGR介导的Tcf7l1/Tcf7l2双敲除小鼠毛囊干细胞 K14rtTA/TRE-mycTcf3和K14rtTA/TRE-Tle4过表达转基因小鼠 Axin2LacZ/+ Wnt报告小鼠毛囊干细胞
重点核对
β-cat cKO HFSCs在体内外均能增殖，但激活后不能生成毛囊而分化为皮脂腺细胞 TCF3/4缺失导致Wnt靶基因上调并引起早发性毛囊周期 TCF3过表达抑制Wnt靶基因表达和HFSC活化 TLE4过表达抑制TCF3/4共靶基因并阻断脱毛诱导的HFSC增殖 TCF3/4与TLE和HDAC1在体内形成复合物并共占据靶基因
摘要
毛囊干细胞（HFSCs）响应Wnt信号而再生毛发。在此，我们展示了β-catenin–TCF3/4–TLE电路的基因组范围转录和染色质景观，并在天然HFSC微环境中对其生物学作用进行了遗传学剖析。我们发现，在HFSC静息期，TCF3、TCF4和TLE（Groucho）协同结合并转录抑制Wnt靶基因。我们还发现，β-catenin对HFSC存活并非必需，并且如果TCF3/4水平充分降低，其对增殖也非必需。然而，β-catenin对于激活启动毛囊命运和抑制皮脂腺细胞命运决定的基因是必需的。TCF3/4缺陷模拟了Wnt–β-catenin依赖的这些毛囊命运靶基因的激活；TCF3过表达则平行于其TLE4依赖的抑制。我们的研究揭示了TCF3/4–TLE组蛋白去乙酰化酶作为一个抑制性变阻器，其作用可被Wnt–β-catenin信号缓解。当TCF3/4和TLE水平高时，HFSCs可维持干性，但保持静息。当这些水平下降或Wnt–β-catenin水平升高时，这种平衡发生偏移，毛发再生启动。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 经典Wnt信号及其下游β-catenin和TCF3/4-TLE复合物如何在天然毛囊干细胞微环境中调控干细胞静息、增殖和命运决定。
- 核心机制
- 在静息HFSCs中，TCF3/4招募TLE和HDAC1抑制Wnt靶基因；Wnt–β-catenin信号解除该抑制，激活毛囊命运基因并抑制皮脂腺命运。
- 主要证据
- 通过条件性基因敲除、过表达小鼠、体内ChIP-seq、RNA-seq、FACS分析和移植实验，证明β-catenin对HFSC维持和增殖非必需，但对毛囊命运决定必需；TCF3/4-TLE作为抑制性变阻器调控静息与激活的平衡。
- 研究意义
- 揭示了TCF3/4-TLE-HDAC1复合物作为Wnt信号调控毛囊干细胞静息和命运决定的抑制性变阻器，为理解成体干细胞如何响应Wnt信号提供机制框架。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
β-catenin缺失HFSCs的体外增殖能力
检验β-catenin缺失是否影响HFSC体外增殖和长期传代能力。
FACS分选CD34+α6+YFP+ Bu-HFSCs，在富血清和生长因子培养基中培养2周，计数克隆数量和大小，并进行长期传代。
β-catenin缺失HFSCs在体内激活后的命运决定
探究β-catenin缺失HFSCs在体内被激活后是否发生命运改变。
将培养的β-cat cKO或对照雄性HFSCs与新生雌性真皮成纤维细胞混合后移植到裸鼠硅胶腔室；或通过脱毛诱导HFSCs激活，进行YFP谱系追踪，检测毛囊和皮脂腺标志物。
β-catenin依赖的转录组和Wnt靶基因鉴定
鉴定β-catenin缺失HFSCs中表达改变的基因，特别是Wnt靶基因和毛囊命运基因。
对早期anagen起始的对照和β-cat cKO Bu-HFSCs进行RNA-seq和qPCR验证；用Wnt3a和/或XAV939处理培养的HFSCs 6小时，检测Wnt响应性。
TCF3/4和TLE在HFSC基因组上的共占据分析
确定TCF3、TCF4和TLE在HFSC中的基因组结合位点及其与β-catenin依赖基因的重叠。
对FACS分选的Bu-HFSCs进行TCF3、TCF4和pan-TLE的ChIP-seq，分析峰重叠、基序富集和靶基因。
TCF3/4和TLE水平改变对HFSC活化和增殖的功能验证
验证TCF3/4和TLE水平变化是否影响HFSC静息、活化和增殖。
使用多西环素诱导的K14rtTA/TRE-mycTcf3和K14rtTA/TRE-Tle4小鼠改变HFSC中TCF3或TLE4水平，通过EdU掺入和克隆形成实验检测增殖；利用K15CrePGR介导的Tcf7l1/Tcf7l2条件性敲除小鼠检测HFSC活化和毛囊周期。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫染色 | TCF3抗体 | Fuchs laboratory | -- |
| TCF4抗体 | Cell Signaling Technology | 2569 | |
| LEF1抗体 | Cell Signaling Technology | 2230 | |
| TCF1抗体 | Cell Signaling Technology | 2203 | |
| CD34抗体 | eBiosciences | 13-0341 | |
| SOX9抗体 | Fuchs laboratory | -- | |
| β-catenin抗体 | BD | clone 14 | |
| GFP抗体 | Abcam | ab13970 | |
| 角蛋白5抗体 | Covance | PRB-160P | |
| 角蛋白10抗体 | Covance | PRB-159P | |
| 整合素β4抗体 | BD | 553745 | |
| PPARγ抗体 | Santa Cruz Biotechnology | H-100, sc-7196 | |
| 免疫沉淀和免疫印迹 | TCF3抗体 | Santa Cruz Biotechnology | V-17, sc-12491 |
| TCF4抗体 | Santa Cruz Biotechnology | N-20, sc-8631 | |
| TLE抗体 | Santa Cruz Biotechnology | C-19, sc-13373 | |
| HDAC1抗体 | Abcam | ab7028 | |
| β-catenin抗体 | Sigma | C7207 | |
| α-微管蛋白抗体 | Millipore | 05829 | |
| FACS | 整合素α6抗体（PE偶联） | eBiosciences | 12-0495 |
| 整合素α6抗体（PE-Cy7偶联） | eBiosciences | 25-0495 | |
| CD34抗体（Alexa Fluor 660偶联） | eBiosciences | 50-0341 | |
| Sca1抗体（PerCP-Cy5.5偶联） | eBiosciences | 45-5981 | |
| ChIP-seq | TCF3抗体 | Fuchs laboratory | -- |
| TCF4抗体 | Santa Cruz Biotechnology | N-20 | |
| pan-TLE抗体 | Santa Cruz Biotechnology | C-19 | |
| 细胞培养 | J2 3T3小鼠成纤维饲养层细胞 | -- | -- |
| 生长因子处理 | Wnt3a重组蛋白 | R&D Systems | -- |
| XAV939 | Selleckchem | -- | |
| RNA纯化 | Direct-zol RNA迷你制备试剂盒 | Zymo Research | -- |
| RNeasy微型试剂盒 | Qiagen | -- | |
| 逆转录 | SuperScript III第一链合成系统 | Invitrogen | -- |
| qPCR | SYBR Green qPCR检测 | -- | -- |
| Applied Biosystems 7900HT快速实时PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| RNA-seq | Illumina TrueSeq mRNA样品制备试剂盒 | Illumina | -- |
| Illumina HiSeq 2000测序仪 | Illumina | -- | |
| Agilent 2100生物分析仪 | Agilent | -- | |
| 免疫沉淀 | Pierce IP裂解缓冲液 | Thermo Scientific | -- |
| Dynabeads蛋白G磁珠 | Invitrogen | -- | |
| 蛋白酶抑制剂 | Roche | -- | |
| 磷酸酶抑制剂 | Roche | -- | |
| LDS样品缓冲液 | Invitrogen | -- | |
| FACS | FluoReporter lacZ流式细胞术试剂盒 | Molecular Probes | -- |
| 细胞培养 | Trizol LS试剂 | Invitrogen | -- |
| 全组织染色 | dispase | Gibco | -- |
| Y染色体原位杂交 | Cy3 Star*FISH检测试剂盒 | Cambio | -- |
| EdU检测 | Click-iT成像试剂盒 | Invitrogen | -- |
| 诱导处理 | RU486 | -- | -- |
| 多西环素 | -- | -- | |
| EdU标记 | EdU | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| β-catenin条件性敲除 | RU486给药方案（1%腹腔注射和4%局部乙醇处理）、观察时间点5个月、小鼠基因型K15CrePGR;Ctnnb1fl/fl;Rosa26-YFPfl/stop/fl 阅读提示：Methods 'Mice, doxycycline induction, and in utero injections'及Figure 1c图注 |
| HFSC体外培养与克隆形成 | 培养基钙浓度0.3 mM、饲养层为丝裂霉素C处理的J2 3T3、接种细胞数100,000分三孔、培养14天 阅读提示：Methods 'Cell culture and growth factor treatment'和'Colony-formation assay and statistical analysis' |
| Wnt3a和XAV939处理 | Wnt3a浓度100 ng/ml、XAV939浓度5 μM、处理时间6小时、饥饿处理16小时（0.1% FBS） 阅读提示：Methods 'Cell culture and growth factor treatment'及Figure 5c图注 |
| ChIP-seq | 每反应10^7细胞、抗体品牌和货号（TCF3：Fuchs实验室；TCF4：Santa Cruz N-20；pan-TLE：Santa Cruz C-19）、峰调用软件MACS、测序深度 阅读提示：Methods 'ChIP-seq and data analyses'及Supplementary Methods |
| 体内过表达和敲除实验 | 多西环素剂量（饮食和0.5 mg/鼠腹腔注射）、EdU剂量50 μg/g、RU486给药方案、皮肤移植时间点（g58、g65） 阅读提示：Methods 'Mice, doxycycline induction, and in utero injections'和'Skin grafting'及Figure 7d,e图注 |