Cdh1基因陷阱小鼠的建立与验证
获得Cdh1功能缺失等位基因并验证其敲除效果。
将BayGenomics的基因陷阱ES细胞克隆（RRJ067）注射入C57BL/6囊胚获得嵌合体，繁育后获得生殖系传递；通过Western blot和LacZ染色分析Cdh1蛋白缺失及表达模式。
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后期促进复合物的衔接蛋白Cdh1对维持复制性寿命及学习记忆至关重要
The adaptor protein of the anaphase promoting complex Cdh1 is essential in maintaining replicative lifespan and in learning and memory.
实验完整度
高包含基因敲除小鼠、MEFs、胎盘组织、电生理和恐惧条件化行为学等多层级实验，并有功能与机制验证。
主要模型
Cdh1基因陷阱敲除小鼠（Cdh1gt/gt和Cdh1+/gt） 小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs） E9.5胚胎及胎盘组织 293T和HeLa细胞系
重点核对
Cdh1gt/gt胚胎在E9.5左右死亡，突变体胎盘缺乏巨细胞且cyclin B1积累。 Cdh1gt/gt MEFs增殖减慢、BrdU掺入减少、p16和Ets2蛋白升高，Ets2半衰期延长。 Ets2敲低可降低p16表达并恢复Cdh1gt/gt MEFs增殖；Ets2DBM比野生型Ets2更强烈抑制野生型MEFs生长并诱导衰老。 Cdh1+/gt小鼠海马L-LTP（四串100 Hz HFS）受损，E-LTP和基础突触传递正常。 Cdh1+/gt小鼠情境恐惧条件化受损，但线索恐惧条件化正常。
摘要
后期促进复合物（APC）或环体是一种多亚基E3泛素连接酶。Cdc20 [fizzy (fzy)或p55CDC]和Cdh1 [Hct1、srw1或fizzy相关蛋白1 (fzr1)]编码两种将底物募集到APC的衔接蛋白。APC-Cdc20和APC-Cdh1均通过介导有丝分裂调节因子（如cyclin B1和securin）的泛素化而参与有丝分裂控制。然而，Cdh1在体内的功能重要性及其功能是否与Cdc20冗余尚不清楚。我们在此报告了对缺乏Cdh1的小鼠的分析。我们发现Cdh1对胎盘发育至关重要，其缺陷导致早期致死。Cdh1缺陷的小鼠胚胎成纤维细胞由于Ets2的稳定和随后p16Ink4a表达的激活而过早进入复制性衰老。这些结果揭示了APC在维持小鼠胚胎成纤维细胞复制性寿命中的意外作用。此外，Cdh1杂合小鼠在海马中表现出晚期长时程增强（L-LTP）缺陷，并且情境恐惧条件化受损，提示Cdh1在学习和记忆中起作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Cdh1在体内的功能是否必要，及其功能是否与Cdc20冗余尚不清楚。
- 核心机制
- Cdh1缺失导致Ets2蛋白稳定，进而激活p16Ink4a转录，引发MEFs早衰；Cdh1还通过影响cyclin B1水平参与胎盘巨细胞内复制。
- 主要证据
- Cdh1gt/gt小鼠胚胎致死和胎盘巨细胞缺失；Cdh1gt/gt MEFs早衰且Ets2稳定、p16升高；Ets2敲低或过表达实验；Cdh1+/gt小鼠L-LTP和情境恐惧条件化缺陷。
- 研究意义
- 揭示了APC-Cdh1在维持成纤维细胞复制性寿命、胎盘发育以及海马依赖的学习记忆中具有重要作用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Cdh1缺失小鼠的胚胎发育与胎盘表型分析
确定Cdh1缺失对体内发育和胎盘形成的影响。
杂合子互交，分析不同发育阶段胚胎；对E9.5胎盘进行H&E染色和cyclin B1免疫染色。
Cdh1缺失MEFs的增殖与衰老分析
研究Cdh1在细胞周期和复制性寿命中的作用。
从E9.0-E9.5胚胎分离MEFs，进行生长曲线（MTT）、BrdU掺入、phospho-H3免疫印迹和衰老相关β-半乳糖苷酶染色。
Cdh1底物及Ets2-p16通路的机制解析
鉴定Cdh1缺失后稳定的底物并阐明其引发衰老的分子机制。
Western blot分析多种细胞周期调节因子；检测p16 mRNA和蛋白；CHX追踪Ets2半衰期；Ets2 shRNA敲低；Ets2和Ets2DBM过表达；免疫共沉淀检测Cdh1与Ets2相互作用。
Cdh1杂合小鼠的突触可塑性与学习记忆行为评估
确定Cdh1表达降低对海马突触功能和学习记忆的影响。
制备海马切片，记录Schaffer collateral-CA1突触的fEPSP，诱导E-LTP和L-LTP；进行情境和线索恐惧条件化行为测试。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 细胞增殖检测 | 细胞增殖试剂盒（MTT） | Roche | -- |
| Western blot | 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- |
| 抗Cdh1抗体（克隆DH01） | Abcam | -- | |
| 抗p27抗体 | Cell Signaling Technology | 2552 | |
| 抗Cdc20抗体 | Santa Cruz Biotech. | sc-8358 | |
| 抗cyclin B1抗体 | Santa Cruz Biotech. | sc-752 | |
| 抗Aurora B抗体 | BD Biosciences | 611083 | |
| 抗Skp2抗体 | Santa Cruz Biotech. | sc-764 | |
| 抗p21抗体 | Santa Cruz Biotech. | sc-397-G | |
| 抗Plk1抗体 | Santa Cruz Biotech. | sc-17783 | |
| 抗磷酸化H3抗体 | Millipore Corporation | 06-570 | |
| 抗Flag抗体 | Sigma | A8592 | |
| 抗myc抗体 | Sigma | M5546 | |
| Ets2敲低 | 逆转录病毒Ets2 shRNA载体（V2MM_39638） | Open Biosystems | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| Cdh1基因陷阱小鼠的建立与验证 | 基因陷阱ES细胞克隆来源（RRJ067，BayGenomics）、插入位点（Cdh1内含子5）、嵌合体注射背景（C57BL/6囊胚）、生殖系传递验证、Western blot所用抗体及LacZ染色方法。 阅读提示：Methods 'Generation and analysis of Cdh1 Knockout Mice' 及 Fig. S1。 |
| Cdh1缺失小鼠的胚胎发育与胎盘表型分析 | 胚胎取材时间点（E8.5、E9.5）、胎盘H&E和cyclin B1免疫染色条件、突变体基因型鉴定。 阅读提示：Methods 'Generation and analysis of Cdh1 Knockout Mice' 及 Fig. 1。 |
| Cdh1缺失MEFs的增殖与衰老分析 | MEFs分离胚胎期（E9.0–E9.5）、培养基成分（DMEM、2 mM谷氨酰胺、1%青霉素/链霉素、15% FBS）、实验用细胞代次（P2或更高，生长曲线用P3和P6）、MTT和BrdU实验条件、独立实验重复数（三个独立实验）。 阅读提示：Methods 'Cell Culture' 及 Fig. 2。 |
| Cdh1底物及Ets2-p16通路的机制解析 | CHX处理浓度和时间、Ets2 shRNA序列（GGGATTTATGTAGCAGCTATT）及敲低效率、Ets2DBM突变（D-box RGTL突变为GGTV）、瞬转DNA量、免疫共沉淀条件、抗体货号。 阅读提示：Methods 'Western blot analysis and antibodies' 及 Fig. 3、Fig. 4、Fig. S3。 |
| Cdh1杂合小鼠的突触可塑性与学习记忆行为评估 | 小鼠周龄（10–16周）、海马切片厚度（400 μm）、灌流液成分和流速（1.5 ml/min）、HFS参数（100 Hz、1 s、串间隔5 min）、fEPSP基线强度（最大反应的35–50%）、恐惧条件化足底电击强度（0.7 mA、2 s）、每组小鼠和切片数量（E-LTP：每组5只小鼠，每只5片；L-LTP：每组8只小鼠，每只10片；行为：12只野生型和12只杂合）。 阅读提示：Methods 'Electrophysiology'、'Behavior testing' 及 Fig. 5。 |