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        基因靶向的mTORC1抑制剂揭示核内mTORC1对转录的调控

        Genetically targeted mTORC1 inhibitor reveals transcriptional control by nuclear mTORC1.

        作者信息Yanghao Zhong, Ayse Z Sahan, Zhengyao Shao, Qian-Yi Zhang, Xin Zhou, Jack G Haggett, Keiichi Koshizuka, Samuel A Myers, J Silvio Gutkind, Jin Zhang
        PMID42135521
        期刊Nat Chem Biol
        发布时间2026-11
        DOI10.1038/s41589-026-02188-z
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        包含体外细胞模型、FRET生物传感器、RNA-seq、IP-MS、体外激酶实验及细胞功能验证，具备功能与机制验证。

        主要模型

        NIH3T3小鼠成纤维细胞系 CAL33人口腔鳞状细胞癌细胞系 HEK293T人胚肾细胞系 HeLa人宫颈癌细胞系

        重点核对

        NIH3T3细胞中双饥饿后以50 ng ml−1 PDGF刺激，用TORCAR FRET报告mTORC1活性 TerminaTOR与mTORC1组分mTOR和Raptor的相互作用经RFP免疫沉淀和IP-MS验证 Lyso-TerminaTOR靶向溶酶体后检测Lyso-TORCAR响应及GFP–LC3斑点形成 Nuc-TerminaTOR靶向细胞核后检测TORCAR-NLS响应及RNA-seq差异表达基因 Nuc-TerminaTOR对p300介导的H3K56乙酰化的影响及CCAAT基序荧光素酶报告基因活性

        摘要

        机制性雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1）是一种营养传感器，整合多种输入信号以调控蛋白质翻译和细胞生长。虽然经典模型认为mTORC1在溶酶体上被激活，但越来越清楚的是，这一多面性信号复合物在多个亚细胞定位中具有活性，例如细胞核。然而，mTORC1在这些定位中发挥何种具体功能以及其信号如何被区室化尚不清楚。为了探究mTORC1的亚细胞池，我们开发了TerminaTOR，一种可遗传编码的mTORC1抑制剂，能够被靶向到特定亚细胞定位。当TerminaTOR被导向溶酶体时，它抑制经典的溶酶体mTORC1并诱导自噬。此外，靶向到细胞核的TerminaTOR特异性抑制核内mTORC1，揭示了核内mTORC1在调控含CCAAT基序基因转录中的非经典作用。因此，mTORC1表现出功能性的空间区室化，TerminaTOR可作为强大工具，用于揭示mTORC1在不同尺度上空间调控的功能。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        mTORC1在不同亚细胞定位中发挥何种具体功能，其信号如何被区室化，尤其是核内mTORC1的功能尚不清楚。
        核心机制
        核内mTORC1通过调控p300组蛋白乙酰转移酶活性，促进含CCAAT基序基因的转录，进而影响细胞增殖和活力。
        主要证据
        利用亚细胞靶向的TerminaTOR在NIH3T3和CAL33等细胞中特异性抑制溶酶体或核内mTORC1；FRET生物传感器显示核内mTORC1活性被抑制；RNA-seq和基序分析发现CCAAT基序富集；荧光素酶报告基因、RT–qPCR、H3K56乙酰化检测及p300激活剂/抑制剂实验支持p300介导机制；细胞计数和集落形成实验显示核内mTORC1抑制降低细胞增殖和活力。
        研究意义
        揭示了mTORC1的功能性空间区室化，提供了可遗传编码、亚细胞靶向的mTORC1抑制剂工具，有助于理解mTORC1在正常生理和疾病（如癌症）中的作用，并指导更特异靶向致病性亚细胞mTORC1功能的药理学策略开发。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        开发基于PRAS40的mTORC1抑制剂TerminaTOR

        获得可遗传编码、特异性抑制mTORC1的抑制剂

        构建一系列PRAS40截短片段，与mCherry标签共表达于稳定表达TORCAR的NIH3T3细胞，经双饥饿和PDGF刺激后检测TORCAR荧光发射比率变化；进一步用Western blot检测S6K1磷酸化，并通过RFP免疫沉淀验证与mTORC1组分相互作用。

        2

        表征TerminaTOR对mTORC1的特异性

        验证TerminaTOR选择性抑制mTORC1而不影响mTORC2和其他信号通路

        在NIH3T3细胞中比较TerminaTOR、Torin 1和雷帕霉素对S6K1、4EBP1、Akt S473和GSK3β S9磷酸化的影响；利用AktAR2、AKAR4和CKAR2 FRET生物传感器检测Akt、PKA和PKC活性；通过IP-MS分析TerminaTOR相互作用蛋白。

        3

        构建溶酶体靶向TerminaTOR并验证其功能

        验证溶酶体mTORC1在抑制自噬中的作用

        将TerminaTOR与LAMP1来源序列融合构建Lyso-TerminaTOR，检测其溶酶体定位及与mTOR相互作用；用Lyso-TORCAR检测溶酶体mTORC1活性；用GFP–LC3和RFP–GFP–LC3检测自噬；通过Western blot检测ATG16L1、TFEB和ULK1磷酸化。

        4

        构建核靶向TerminaTOR并验证其特异性

        获得特异性抑制核内mTORC1的工具并验证其空间特异性

        比较SV40 NLS和H2A标签等核定位策略，引入NES突变（L225A和L227A）优化核定位，构建Nuc-TerminaTOR；用TORCAR-NLS、TORCAR-NES和Lyso-TORCAR检测不同亚细胞池mTORC1活性；用GFP–LC3检测自噬；通过IP-MS和体外NEK7激酶实验评估特异性。

        5

        利用RNA-seq和基序分析探究核内mTORC1调控的转录程序

        确定核内mTORC1调控的基因和启动子基序

        在稳定表达Nuc-TerminaTOR或H2A–mCherry的NIH3T3细胞中，经双饥饿、CHX和PDGF处理后进行RNA-seq，鉴定差异表达基因；用Homer分析启动子富集基序；用含CCAAT基序的Rhob启动子荧光素酶报告基因验证基序功能。

        6

        验证p300在核内mTORC1调控转录中的作用

        确定核内mTORC1调控CCAAT基序基因转录的介导因子

        检测Nuc-TerminaTOR对p300介导的H3K56乙酰化的影响；使用p300激活剂CTB和抑制剂C646处理，通过RT–qPCR检测CCAAT基序基因表达；用Western blot检测乙酰化H3K56。

        7

        评估核内mTORC1对细胞增殖和活力的影响

        验证核内mTORC1调控转录的细胞功能后果

        在NIH3T3和CAL33细胞中稳定表达多西环素诱导的Nuc-TerminaTOR或H2A–mCherry，进行细胞计数、细胞活力检测和集落形成实验。

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        验证样本或模型特征
        免疫荧光共聚焦显微镜活细胞落射荧光成像
        验证细胞功能变化
        GFP–LC3斑点实验RFP–GFP–LC3串联自噬实验细胞生长实验细胞活力检测集落形成实验
        验证分子表达变化
        蛋白质印迹逆转录定量PCR荧光素酶报告基因实验
        验证机制链路
        FRET生物传感器成像免疫沉淀免疫沉淀-质谱联用体外激酶实验RNA测序基序富集分析
        数据分析与统计
        差异表达分析通路分析单因素方差分析及Dunnett多重比较检验双侧Student t检验

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        药物处理血小板衍生生长因子SigmaP3201
        细胞培养线粒体红色荧光探针Thermo Fisher ScientificM22425
        溶酶体绿色荧光探针Thermo Fisher ScientificL7526
        药物处理Torin 1TOCRIS4247
        GDC-0068APExBIORG7440
        二甲基亚砜SigmaD2650
        多西环素Clontech631311
        CTBSigma-AldrichC6499
        C646Sigma-AldrichSML0002
        亮氨酸甲酯Sigma-AldrichL1002
        甲基-β-环糊精Sigma-Aldrich332615
        胆固醇Sigma-AldrichC8667
        细胞培养去脂血清Kalen Biomedical880100-1
        PolyJet转染试剂SignaGen LaboratoriesSL100688
        Polybrene转染试剂MilliporeTR-1003-G
        免疫沉淀RFP捕获磁珠Chromotekrtma
        无EDTA蛋白酶抑制剂Roche11873580001
        体外激酶实验重组mTORC1Sigma-AldrichSRP0364
        Maf1蛋白Antibodies OnlineABIN5711827
        NEK7激酶实验试剂盒BPS Bioscience78850
        ADP-Glo检测试剂PromegaV6930
        Western blot抗磷酸化S6K1 (T389)抗体Cell Signaling Technology9205
        抗S6K1抗体Cell Signaling Technology9202
        抗乙酰化H3K56抗体Cell Signaling Technology4243
        抗H3抗体Cell Signaling Technology9715
        抗磷酸化4EBP1 (T37/46)抗体Cell Signaling Technology2855
        抗4EBP1抗体Cell Signaling Technology9452
        抗磷酸化GSK3β (S9)抗体Cell Signaling Technology9322
        抗磷酸化Akt (S473)抗体Cell Signaling Technology9271
        抗Akt抗体Cell Signaling Technology9272
        抗mTOR抗体Cell Signaling Technology2972
        抗Raptor抗体Cell Signaling Technology2280
        抗TSC2抗体Cell Signaling Technology3612
        抗微管蛋白抗体Cell Signaling Technology2146
        抗ATG16L1B抗体Cell Signaling Technology8089
        抗ULK1抗体Cell Signaling Technology8054
        抗磷酸化ULK1 (S757)抗体Cell Signaling Technology6888
        抗磷酸化TFEB S211抗体Cell Signaling Technology37681
        抗6×His标签抗体Thermo Fisher ScientificMA1–21315-HRP
        抗TFEB抗体Thermo Fisher ScientificA303–673A
        抗RFP抗体Antibodies OnlineABIN129578
        抗磷酸化ATG16L1 S278抗体AbCamab195242
        泛磷酸化丝氨酸/苏氨酸抗体ABclonalAP1067
        抗GSK3β抗体BD Biosciences610201
        HRP标记的山羊抗兔二抗PiercePI31460
        HRP标记的山羊抗鼠二抗PiercePI31430
        HRP化学发光底物Thermo Fisher Scientific34579
        HRP化学发光底物Thermo Fisher Scientific34076
        免疫荧光抗mTOR抗体Cell Signaling2972
        抗LAMP1抗体Santa Cruzsc20011
        AlexaFluor 488标记抗兔二抗Life TechnologiesA-11001
        AlexaFluor 562标记抗鼠二抗Life TechnologiesA-21422
        含NucBlue的抗荧光淬灭封片剂InvitrogenP36981
        RNA提取Direct-zol RNA小量制备试剂盒Zymo ResearchR2051
        RT–qPCRPrimeScript逆转录预混液TakaraRR036A
        iTaq Universal SYBR green预混液Bio-rad1725121
        荧光素酶实验双荧光素酶报告基因检测试剂盒PromegaE1910
        细胞活力检测Aquabluer试剂MultiTarget Pharmaceuticals6015

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        TerminaTOR开发与验证
        PRAS40片段选择（114–245A）、S183A和T246截短、TORCAR报告系统、PDGF浓度50 ng ml−1、双饥饿条件、细胞数n
        阅读提示：Fig. 1b图注及Methods中Constructs and cloning、Cell culture, transfection and starvation小节
        Lyso-TerminaTOR功能验证
        LAMP1靶向序列、Lyso-TORCAR检测、GFP–LC3斑点计数、双饥饿与非饥饿对照、PDGF 50 ng ml−1
        阅读提示：Fig. 3图注及Methods中Autophagy assays小节
        Nuc-TerminaTOR核定位与特异性
        H2A标签、NES突变（L225A/L227A）、TORCAR-NLS/NES检测、H2A–mCherry对照、PDGF 50 ng ml−1
        阅读提示：Fig. 4图注、Extended Data Fig. 5及Methods中Constructs and cloning小节
        RNA-seq实验
        多西环素100 ng ml−1诱导24小时、血清饥饿24小时、氨基酸饥饿1.5小时、CHX 25 μg ml−1处理0.5小时、雷帕霉素100 nM处理0.5小时、PDGF 50 ng ml−1处理3小时、三重复
        阅读提示：Fig. 5a及Methods中mRNA sequencing and analyses小节
        p300机制验证
        CTB 50 μM、C646 10 μM、乙酰-H3K56 Western blot、RT–qPCR引物序列
        阅读提示：Fig. 5f,g图注及Methods中Reagents and drug treatment、Reverse transcription (RT)–qPCR小节
        细胞增殖与活力实验
        NIH3T3接种10,000细胞/孔48小时计数、CAL33接种3,000细胞/孔72小时活力检测、CAL33接种1,000细胞/孔7–9天集落形成、多西环素浓度（NIH3T3 100 ng ml−1，CAL33 1 μg ml−1）
        阅读提示：Fig. 5h,i图注及Methods中Cell growth assay、Cell viability assay、Colony formation assay小节

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