化合物库抗白血病活性筛选
评估withanolide衍生化合物对白血病细胞系的细胞毒性，并筛选出活性化合物。
用52个化合物的库处理9种白血病细胞系72小时，通过CellTiter-Glo检测细胞活力；用cell painting分析形态学特征。
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Orpinolide通过抑制OSBP破坏白血病细胞对胆固醇转运的依赖性
Orpinolide disrupts a leukemic dependency on cholesterol transport by inhibiting OSBP.
实验完整度
高多组学、CRISPR筛选、TPP、CETSA、体外转运及细胞功能验证等多层级证据
主要模型
KBM7细胞系 Jurkat和LOUCY等白血病细胞系 HeLa细胞和大鼠软骨肉瘤RCS细胞 非恶性外周血单核细胞PBMCs
重点核对
W7处理KBM7细胞8小时，1 μM，n=2生物学重复，TMT定量蛋白质组学 W7处理KBM7细胞6小时，485 nM，n=3生物学重复，RNA测序 全基因组CRISPR–Cas9筛选：KBM7-Cas9细胞，W7起始浓度243 nM，处理20天 TPP：KBM7细胞，W7 5 μM处理2小时，八温度梯度37–62°C，n=2生物学重复 CETSA：W7 5 μM处理2小时或1 μM处理4小时，免疫印迹或HiBiT发光检测
摘要
癌症中的代谢改变会导致相关的依赖性，这些依赖性可以被治疗性地利用。为了实现这一目标，受天然产物启发的小分子可以提供宝贵的化学型资源。在这里，我们通过正交化学筛选鉴定出orpinolide，一种具有显著抗白血病特性的合成withanolide类似物。通过多组学分析和全基因组CRISPR–Cas9筛选，我们发现orpinolide通过一种需要内质网-高尔基体膜界面活跃的磷脂酰肌醇4-磷酸信号传导的机制破坏高尔基体稳态。热蛋白质组分析和遗传验证研究表明，氧化固醇结合蛋白OSBP是orpinolide的直接且表型相关的靶点。总的来说，这些数据重申了甾醇转运是白血病中一个可治疗性利用的依赖性，并推动了通过探针样化合物orpinolide进行的后续转化研究。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探究withanolide衍生化合物的抗白血病机制，并鉴定其直接靶点及相关的代谢依赖性。
- 核心机制
- Orpinolide通过抑制OSBP，阻断ER–Golgi膜接触位点依赖PI4P的胆固醇转运，破坏高尔基体稳态，进而抑制白血病细胞增殖。
- 主要证据
- 多组学显示高尔基体蛋白 destabilization 和胆固醇合成下调；CRISPR筛选揭示依赖PI4P信号；TPP和CETSA证实OSBP为直接靶点；体外实验证明抑制甾醇转运；OSBP过表达和敲除实验验证其功能相关性。
- 研究意义
- 重申甾醇转运是白血病中可成药代谢依赖性，并将orpinolide作为研究OSBP/ORP4胆固醇转运的探针分子，推动后续转化研究。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
多组学分析W7的细胞效应
探究W7处理后的蛋白质组和转录组变化，以了解其作用机制。
对KBM7细胞进行TMT定量蛋白质组学和RNA测序，分析差异表达蛋白和基因。
全基因组CRISPR–Cas9筛选鉴定W7敏感性相关基因
鉴定W7抗增殖效应所需的细胞效应器。
在KBM7-Cas9细胞中进行Brunello sgRNA文库筛选，用W7或DMSO处理20天，通过测序分析sgRNA富集。
热蛋白质组分析鉴定W7直接靶点
无偏鉴定W7在KBM7细胞中的直接蛋白质靶点。
用W7或DMSO处理KBM7细胞，进行八温度梯度热变性，TMT标记和LC-MS/MS分析，NPARC鉴定熔解曲线变化。
CETSA验证OSBP结合
验证W7与OSBP的直接结合。
用W7处理KBM7细胞，通过免疫印迹或HiBiT发光检测OSBP热稳定性。
体外胆固醇转运实验
评估W7对OSBP介导的胆固醇转运功能的影响。
使用荧光偏振竞争实验和FRET-based脂质体转运实验，检测W7对OSBP ORD结构域与胆固醇结合及转运的影响。
OSBP功能验证
验证OSBP抑制是否介导W7的抗白血病效应。
通过OSBP过表达和CRISPR敲除实验，检测对W7敏感性的影响；通过免疫荧光和转运实验检测OSBP抑制对高尔基体功能的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证分子表达变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | IMDM培养基 | -- | -- |
| RPMI培养基 | -- | -- | |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Glo细胞活力检测试剂盒 | Promega | G7573 |
| 转染 | 聚乙烯亚胺MAX | Polysciences | 24765-100 |
| 聚凝胺 | Santa Cruz | SC-134220 | |
| 筛选 | 嘌呤霉素 | Gibco | A1113803 |
| Western blot | OSBP抗体 | Bethyl | A304-553A |
| GAPDH抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-365062 | |
| GOLIM4抗体 | Thermo Scientific | PA5-51624 | |
| PITPNB抗体 | Bethyl | A305-591A | |
| GALNT2抗体 | Abcam | ab262868 | |
| 磷酸化AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 4060T | |
| AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 4691T | |
| HA抗体 | Cell Signaling Technology | 3724S | |
| 过氧化物酶标记AffiniPure山羊抗兔IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-003 | |
| 蛋白质组学 | TMT 16-plex标记试剂 | Thermo Scientific Pierce | -- |
| Pierce BCA蛋白测定试剂盒 | Thermo Scientific | 23225 | |
| RNA测序 | RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | 74106 |
| Qubit RNA HS试剂盒 | Thermo | Q32852 | |
| Corall总RNA测序文库制备试剂盒 | Lexogen | 095 | |
| CRISPR筛选 | Brunello sgRNA文库 | Addgene | 12260 |
| QIAamp DNA Mini试剂盒 | Qiagen | 51306 | |
| 流式细胞术 | LSRFortessa流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| 免疫荧光 | OSBP抗体 | Atlas Antibodies | HOA039227 |
| TGN46抗体 | Bio-Rad | AHP500GT | |
| PC2抗体 | Hybridoma Bank | II6B3 | |
| giantin抗体 | Institut Curie | A-R-R#05 | |
| Alexa Fluor 488山羊抗兔 | Invitrogen | A11008 | |
| Alexa Fluor 488山羊抗小鼠 | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa Fluor 568山羊抗小鼠 | Invitrogen | A11031 | |
| Alexa Fluor 647驴抗羊 | Invitrogen | A21448 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | -- | |
| Fluoromount-G封片剂 | Invitrogen | -- | |
| HiBiT CETSA | Nano-Glo HiBiT裂解检测系统 | Promega | N3040 |
| 体外转运实验 | 1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱 | Avanti Polar Lipids | 850375C |
| TopFluor胆固醇 | Avanti Polar Lipids | 810255 | |
| 荧光偏振 | 22-NBD-胆固醇 | -- | -- |
| Spark Cyto多模式微孔板阅读器 | Tecan | -- | |
| 质谱 | Orbitrap Fusion Lumos三合一质谱仪 | Thermo Scientific | -- |
| Dionex UltiMate 3000 RSLCnano系统 | Thermo Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 化合物库筛选 | 化合物浓度范围、处理时间、细胞系、生物学重复数 阅读提示：Methods: Phenotypic screening of the withanolide-inspired compound collection |
| 蛋白质组学 | W7浓度、处理时间、细胞数、生物学重复数 阅读提示：Methods: Expression proteomics |
| RNA测序 | W7浓度、处理时间、生物学重复数、RNA提取和建库方法 阅读提示：Methods: RNA sequencing |
| CRISPR–Cas9筛选 | 细胞系、MOI、W7起始浓度、处理时长、文库覆盖度 阅读提示：Methods: Genome-wide CRISPR–Cas9 knockout screen |
| 热蛋白质组分析 | W7浓度、处理时间、温度梯度、生物学重复数 阅读提示：Methods: Thermal proteome profiling in intact cells |
| CETSA | W7浓度、处理时间、温度梯度、检测方法 阅读提示：Methods: Cellular thermal shift assay in intact cells |
| 体外胆固醇转运实验 | 蛋白浓度、脂质体浓度、W7浓度、FRET检测参数 阅读提示：Methods: Sterol transfer assay |
| OSBP功能验证 | 过表达构建体、敲除sgRNA、W7处理浓度和时间 阅读提示：Methods: Flow cytometry analysis of OSBP/ORP4 essentiality 和 Results相关部分 |