AsCas12f点突变体筛选
鉴定能提高基因编辑活性的单氨基酸替换。
基于同源蛋白序列比对，在AsCas12f中引入32个单点突变，转染HEK293T细胞，靶向TP53和HEXA位点，通过靶向深度测序和CRISPResso分析indel频率。
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一种基因编辑活性提升的工程化超紧凑CRISPR-Cas12f系统
An engineered hypercompact CRISPR-Cas12f system with boosted gene-editing activity.
实验完整度
高包含体外DNA切割、HEK293T/HeLa/HCT116细胞编辑、冷冻电镜结构、GUIDE-seq脱靶分析等多层级验证。
主要模型
HEK293T细胞 HeLa细胞 HCT116细胞 AsCas12f-sgRNA-DNA复合物
重点核对
enAsCas12f在HEK293T细胞中17个基因组位点的 indel 频率（41.4±16.6%） 体外DNA切割活性在37 °C和50 °C的时间进程 冷冻电镜结构分辨率2.9 Å及二聚体界面 GUIDE-seq检测脱靶编辑，使用5个靶位点 sgRNA-v2相比全长sgRNA缩短72 nt且活性相当
摘要
紧凑型CRISPR-Cas系统为遗传疾病提供了多种治疗选择，但其应用常受限于基因编辑活性不高。本文中，我们展示了一种工程化的RNA引导DNA内切酶enAsCas12f，其活性最高可达亲本蛋白AsCas12f的11.3倍，而大小仅为SpCas9的三分之一。enAsCas12f在体外显示出比野生型AsCas12f更高的DNA切割活性，并在人类细胞中广泛发挥作用，在用户指定的基因组位点可实现高达69.8%的插入和缺失。观察到enAsCas12f的脱靶编辑极少，提示增强的靶向活性并未损害全基因组特异性。我们以2.9 Å分辨率解析了AsCas12f-sgRNA-DNA复合物的冷冻电镜结构，揭示了二聚化介导的底物识别与切割机制。基于结构的单链引导RNA（sgRNA）工程化改造获得了sgRNA-v2，其长度比全长sgRNA短33%，但活性相当。总之，工程化的超紧凑AsCas12f系统能够在哺乳动物细胞中实现稳健且忠实的基因编辑。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否通过工程化改造AsCas12f提高其基因编辑活性，同时保持紧凑性和特异性？
- 核心机制
- 通过引入正电荷残基增强AsCas12f与sgRNA和靶DNA的静电相互作用，促进复合物形成和底物结合；二聚化介导底物识别与切割。
- 主要证据
- enAsCas12f在体外DNA切割和人类细胞indel形成中活性显著高于野生型；冷冻电镜结构揭示突变残基位于sgRNA磷酸骨架附近；GUIDE-seq显示脱靶编辑极少。
- 研究意义
- enAsCas12f作为一种高效且紧凑的CRISPR系统，为基于CRISPR的基因编辑和体内递送提供了新工具。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
有益突变组合与enAsCas12f获得
通过组合有益单突变获得活性更高的AsCas12f变体。
构建双、三、四、五重突变体，在HEK293T细胞中测试indel频率，鉴定最佳变体AsCas12f-v5.2（enAsCas12f）。
体外DNA切割活性验证
比较野生型AsCas12f和enAsCas12f的DNA切割活性。
使用PCR扩增的954 bp dsDNA底物（含TP53-1位点），与sgRNA和纯化的蛋白孵育，在37 °C和50 °C下进行时间进程切割实验，琼脂糖凝胶电泳分析。
enAsCas12f在多种人类细胞中的基因组编辑评估
评估enAsCas12f在人类基因组多个位点的编辑效率和广度。
在HEK293T、HeLa和HCT116细胞中，针对17个基因组位点（覆盖TTTG、TTTA、ATTG、CTTG PAM），转染AsCas12f变体和sgRNA，3天后测序分析indel频率。
冷冻电镜结构解析
揭示AsCas12f-sgRNA-DNA复合物的结构基础及突变残基的作用。
组装AsCas12f(D225A)-sgRNA-靶DNA复合物，冷冻制样，数据收集和处理，解析2.9 Å分辨率结构。
基于结构的sgRNA工程化
通过截短sgRNA获得更紧凑且活性相当的sgRNA。
设计系列sgRNA截短体，在HEK293T细胞中测试indel频率，获得sgRNA-v2（缩短72 nt），并验证其体外切割活性和细胞编辑活性。
GUIDE-seq脱靶分析
评估工程化AsCas12f的全基因组特异性。
对5个靶位点进行GUIDE-seq，通过dsODN整合标记DNA断裂位点，测序分析脱靶位点。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证基因编辑活性
评估脱靶效应
评估转录激活
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 质粒构建 | Phusion U DNA聚合酶 | Thermo Fisher | F555S |
| USER酶混合物 | New England Biolabs | M5505L | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | 11995 |
| DMEM培养基 | Gibco | 11965 | |
| McCoy's 5A培养基 | Gibco | 16600 | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素和链霉素 | Gibco | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Fisher | 11668019 |
| 细胞裂解 | 蛋白酶K | Thermo Fisher | EO0491 |
| 靶向深度测序 | Taq DNA聚合酶 | New England Biolabs | M0273L |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher | 15596026 |
| 逆转录 | Maxima H Minus cDNA合成预混液 | Thermo Fisher | M1661 |
| sgRNA表达水平评估 | 大肠杆菌Poly(A)聚合酶 | New England Biolabs | M0276S |
| RNA纯化 | RNA清洁与浓缩试剂盒 | Zymo Research | R1014 |
| 逆转录 | SuperScript III逆转录酶 | Thermo Fisher | 18080044 |
| Western blot | HRP偶联抗Flag单克隆抗体 | Sigma-Aldrich | A8592-.2MG |
| HRP偶联GAPDH单克隆抗体 | Proteintech | HRP-60004 | |
| sgRNA制备 | T7 RNA聚合酶 | New England Biolabs | M0251L |
| Turbo DNase | Thermo Fisher | AM2238 | |
| 蛋白纯化 | Ni-NTA琼脂糖珠 | QIAGEN | -- |
| Amicon Ultra-15离心过滤器 | Millipore Sigma | -- | |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL色谱柱 | GE Healthcare | -- | |
| 冷冻电镜制样 | Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher | -- |
| 多孔碳膜载网（Quantifoil 200目铜网1.2/1.3） | Quantifoil | -- | |
| 标准Vitrobot滤纸 | Ted Pella | 47000–100 | |
| 冷冻电镜数据收集 | Titan Krios透射电子显微镜 | Thermo Fisher | -- |
| K3直接电子探测器 | Gatan | -- | |
| GUIDE-seq | 4D-Nucleofector电转仪 | Lonza | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与转染 | 细胞系来源（HEK293T ATCC CRL11268；HeLa ATCC CCL2；HCT116 ATCC CCL-247）、培养基（DMEM Gibco 11995/11965；McCoy's 5A Gibco 16600）、转染试剂（Lipofectamine 2000）及质粒用量（120 ng AsCas12f和120 ng sgRNA） 阅读提示：Methods: Cell culture和Evaluation of indel frequencies |
| indel频率检测 | 转染后3天收获，裂解液组成，PCR扩增200-400 bp区域，Illumina Miseq 150 bp双端测序，CRISPResso分析参数（Cpf1模式，2 bp定量窗口） 阅读提示：Methods: Evaluation of indel frequencies |
| 体外DNA切割实验 | dsDNA底物浓度（48 nM）、sgRNA浓度（900 μM）、蛋白浓度（900 μM）、反应缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl）、温度（37 °C或50 °C）、时间点 阅读提示：Methods: In vitro DNA cleavage assay |
| 冷冻电镜样品制备与数据收集 | 复合物摩尔比（1:0.5:1.2:1.2）、缓冲液D组成、制样参数（8 °C, 100%湿度，blot 4秒）、电镜参数（300 kV，81,000×，总曝光4秒，40帧，曝光量约50 e-/Å2，defocus -1.0至-2.5 μm） 阅读提示：Methods: Electron microscopy sample preparation和Cryo-EM data collection；Supplementary Table 5 |
| GUIDE-seq | 核转染条件（1.8 μg AsCas12f质粒，1.8 μg sgRNA质粒，5 μL 100 μM dsODN，1百万HEK293T细胞，100 μL核转染缓冲液，4D-Nucleofector），转染后3天收获，测序平台Illumina Nextseq 阅读提示：Methods: GUIDE-seq；Supplementary Table 6 |