DUB抑制剂库细胞表型筛选
鉴定能选择性杀伤突变FLT3表达细胞并诱导FLT3降解的小分子DUB抑制剂
对29个已报道的小分子DUB抑制剂在Ba/F3-FLT3-ITD、Ba/F3-FLT3-D835Y和IL-3依赖的亲本Ba/F3细胞中进行全细胞表型筛选，评估选择性杀伤能力，并对命中化合物进行验证。
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抑制USP10可诱导致癌性FLT3降解
Inhibition of USP10 induces degradation of oncogenic FLT3.
实验完整度
高体外细胞系、原代患者样本、PDX及两种小鼠体内模型，含基因敲低/过表达、靶点结合和机制验证
主要模型
Ba/F3-FLT3-ITD及Ba/F3-wtFLT3细胞系 FLT3-ITD阳性人AML细胞系MOLM13-luc+、MOLM14、MV4,11 FLT3-ITD阳性AML原代患者样本及primagraft Ba/F3-FLT3-ITD-luc+小鼠白血病模型
重点核对
HBX19818和P22077在Ba/F3-FLT3-ITD细胞中的EC50处于个位数微摩尔范围，且部分可被IL-3挽救 HBX19818和P22077在20 μM处理22-24小时后诱导FLT3-ITD降解，对wt FLT3蛋白影响很小或无影响 USP10敲低使用三个独立shRNA，均可导致FLT3-ITD降解并抑制FLT3-ITD阳性细胞生长 HBX19818缩短FLT3-ITD半衰期至约2小时，而对照为3-4小时 P22077在体内50 mg/kg IP BID或PO QD给药4-6天显著降低白血病负荷
摘要
致癌性FLT3激酶是急性髓系白血病（AML）的重要治疗靶点，然而小分子激酶抑制剂的临床应答短暂，原因是点突变或FLT3表达代偿性增加导致快速耐药。我们试图开发一种互补的药理学方法，通过鉴定负责从FLT3上切除泛素的去泛素化酶（DUB）抑制剂，促进蛋白酶体介导的FLT3降解。由于FLT3相关的DUB未知，我们组装了包含大多数已报道小分子DUB抑制剂的聚焦库，并进行细胞表型筛选，以鉴定可诱导致癌性FLT3降解的化合物。随后的靶点去卷积工作使我们鉴定出USP10是稳定FLT3所需的关键DUB。靶向USP10在FLT3-ITD阳性AML临床前模型中显示疗效，包括细胞系、原代患者标本和致癌性FLT3驱动白血病小鼠模型。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否通过鉴定稳定FLT3的去泛素化酶并抑制其活性，促进致癌性FLT3降解，从而克服FLT3激酶抑制剂耐药？
- 核心机制
- USP10是稳定FLT3-ITD的关键去泛素化酶，通过从FLT3上切除泛素标签维持其蛋白稳定性；抑制USP10促进FLT3-ITD泛素化及蛋白酶体和溶酶体介导的降解。
- 主要证据
- DUB抑制剂库细胞表型筛选鉴定HBX19818和P22077；生化实验显示二者抑制USP10的IC50分别为14和6 μM；USP10敲低和过表达实验、USP10与FLT3共免疫沉淀、FLT3半衰期分析，以及在细胞系、原代患者样本和两种小鼠模型中的药效验证。
- 研究意义
- USP10被验证为FLT3突变AML的治疗靶点，靶向USP10可诱导突变FLT3降解并克服激酶抑制剂耐药，且可能通过同时阻断FLT3的酶活性和支架功能而比激酶抑制剂更有效。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
命中化合物诱导FLT3降解及选择性验证
验证命中化合物是否通过诱导突变FLT3蛋白降解而非抑制激酶活性发挥作用，并评估对wt FLT3的选择性
在Ba/F3-FLT3-ITD、Ba/F3-D835Y和wt-FLT3-Ba/F3细胞以及人AML细胞系中，用HBX19818和P22077处理，通过免疫印迹检测FLT3蛋白水平，流式细胞术检测细胞表面FLT3表达，并检测下游AKT和ERK1/2水平。
泛素化介导的降解机制验证
确认化合物诱导的FLT3降解是否通过泛素-蛋白酶体和/或溶酶体途径，并排除转录水平调控
检测HBX19818处理后FLT3-ITD的泛素化水平；用溶酶体抑制剂氯喹挽救FLT3降解；用qPCR检测FLT3 mRNA水平。
靶点去卷积鉴定USP10
鉴定HBX19818和P22077诱导FLT3降解的关键靶点DUB
用33种重组DUB酶进行体外抑制谱分析；用HA-Ub-VS竞争性活性基蛋白质谱分析检测化合物与USP10的结合；检测已知USP10底物Beclin-1的蛋白水平；用HBX19818类似物进行构效关系分析。
USP10基因敲低和过表达验证
验证USP10对FLT3-ITD蛋白稳定性的调控作用，并区分USP7的贡献
用三个独立shRNA敲低USP10或USP7，检测FLT3蛋白水平和细胞生长；在MOLM14细胞中过表达USP10 wt或催化失活USP10C424S，检测FLT3水平；用共免疫沉淀检测USP10与FLT3的相互作用。
USP10对wt和突变FLT3差异稳定性的机制分析
解释USP10抑制选择性降解突变FLT3而非wt FLT3的原因
用环己酰亚胺追踪实验检测wt FLT3和FLT3-ITD的半衰期，比较有无USP10过表达及有无HBX19818处理下的蛋白稳定性差异。
克服FLT3激酶抑制剂耐药的验证
验证USP10抑制诱导的FLT3降解能否克服FLT3激酶抑制剂耐药
在表达TKD点突变的Ba/F3-FLT3-ITD细胞和midostaurin耐药MOLM13细胞中，比较FLT3激酶抑制剂与HBX19818/P22077的活性及FLT3降解效果。
与FLT3激酶抑制剂的协同作用评估
评估USP10抑制剂与FLT3激酶抑制剂联合使用的协同效应
在Ba/F3-FLT3-ITD、MOLM13-luc+和MOLM14细胞中，将HBX19818与midostaurin或crenolib按固定比例系列稀释联合处理，用Calcusyn软件计算组合指数。
原代患者样本和PDX的体外药效验证
在临床相关模型中验证USP10抑制剂的疗效
用HBX19818、P22077及HBX19818类似物处理FLT3-ITD阳性原代AML患者细胞和primagraft细胞，检测细胞存活；在部分样本中检测FLT3蛋白水平。
体内药效验证
在体内验证P22077对FLT3-ITD阳性白血病的治疗效果及FLT3降解作用
在FLT3-ITD+/D835Y+ AML primagraft小鼠模型中给予P22077 15 mg/kg IP QD共21天，检测骨髓FLT3蛋白；在Ba/F3-FLT3-ITD-luc+非侵入性生物发光小鼠模型中给予P22077 50 mg/kg IP BID或PO QD，检测白血病负荷和骨髓FLT3表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | HBX19818 | Medchem Express | -- |
| P22077 | Medchem Express | -- | |
| HBX19818类似物 | ChemDiv | -- | |
| Western blot | 总AKT抗体（兔，#9272） | Cell Signaling Technology | 9272 |
| 总p44/42 MAPK（Erk1/2）（3A7）抗体（鼠，#9107） | Cell Signaling Technology | 9107 | |
| 抗GAPDH（D16H-11）XP（R）抗体（兔单抗，#5174） | Cell Signaling Technology | 5174 | |
| Beclin-1抗体（兔，#3738） | Cell Signaling Technology | 3738 | |
| USP10（D7A5）抗体（兔，#8501） | Cell Signaling Technology | 8501 | |
| P53抗体（兔，#9282） | Cell Signaling Technology | 9282 | |
| β-微管蛋白抗体（兔，#2146s） | Cell Signaling Technology | 2146s | |
| FLT3/Flk-2（C-20）抗体（sc-479） | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-479 | |
| 泛素（P4D1）抗体（鼠，sc-8017） | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-8017 | |
| 抗磷酸酪氨酸抗体（鼠，克隆4G10） | Upstate Biotechnology | -- | |
| 抗HAUSP/USP7抗体（兔，ab4080） | Abcam | ab4080 | |
| 抗泛素抗体（兔，ab7780） | Abcam | ab7780 | |
| 细胞培养 | RPMI培养基 | Mediatech, Inc. | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| L-谷氨酰胺 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | -- | -- | |
| WEHI条件培养基 | -- | -- | |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Glo发光细胞活力检测 | Promega | -- |
| 流式分析 | CD135-PE偶联抗体（Cat. # IM2234U） | Beckman Coulter | IM2234U |
| 抗细胞色素C克隆6H2.B4-Alexafluor 647偶联抗体 | BD Bioscience | -- | |
| qPCR | RNEasy迷你试剂盒 | Qiagen | -- |
| SuperScript III逆转录酶 | ThermoFisher | -- | |
| TaqMan探针 | -- | -- | |
| 7500 FAST实时PCR系统 | ThermoFisher | -- | |
| SimpliAmp热循环仪 | ThermoFisher | -- | |
| 靶点结合实验 | HA-泛素-乙烯基甲基砜 | -- | -- |
| Western blot | HALT蛋白酶抑制剂混合物 | ThermoFisher | -- |
| Peirce ECL免疫印迹底物 | ThermoFisher | -- | |
| 780 nm IRdye山羊抗兔IgG | Licor | -- | |
| Odyssey扫描仪 | Licor | -- | |
| 蛋白纯化 | Ni-NTA珠 | Qiagen | -- |
| HiPrep 26/10脱盐柱 | GE Healthcare | -- | |
| Superdex 200 10/300GL柱 | GE Healthcare | -- | |
| 泛素-AMC实验 | 泛素-AMC | Boston Biochem | -- |
| Clariostar荧光板读数仪 | -- | -- | |
| MALDI-TOF DUB实验 | UltrafleXtreme MALDI-TOF质谱仪 | Bruker Daltonics | -- |
| MTP AnchorChip 1,536 TF | Bruker Daltonics | -- | |
| 基因敲低 | pLKO.1puro慢病毒shRNA载体颗粒 | Sigma-Aldrich | -- |
| 聚凝胺 | -- | -- | |
| 基因过表达 | FLAG-HA-USP10 | Addgene | 22543 |
| psPAX2 | addgene | 12260 | |
| pMD2.G | addgene | 12259 | |
| LENTI-X浓缩试剂 | Clontech | -- | |
| 转染 | 聚乙烯亚胺 | Polysciences | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| DUB抑制剂库细胞表型筛选 | 29个DUB抑制剂的来源和组成；Ba/F3-FLT3-ITD、Ba/F3-FLT3-D835Y和亲本Ba/F3细胞的培养条件；化合物浓度范围和处理时间 阅读提示：Results第一段及Supplementary Results、Supplementary Table 1、Supplementary Figure 1a |
| HBX19818和P22077诱导FLT3降解 | 化合物浓度（20 μM）；处理时间（22-24小时）；细胞系（Ba/F3-FLT3-ITD、MOLM13-luc+、MOLM14）；免疫印迹检测的FLT3抗体 阅读提示：Figure 1d-f、Figure 2b及对应图注；Online Methods的Immunoblotting部分 |
| USP10靶点去卷积 | 重组DUB酶种类和浓度（33种，10 μM化合物）；HA-Ub-VS用量（0.25 μg）和标记条件（室温30分钟）；Ubiquitin-AMC实验的USP10浓度（10 nM）和底物浓度（2 μM） 阅读提示：Figure 3a-b、Figure 3f及图注；Online Methods的Ubiquitin-AMC assay和MALDI TOF DUB assays部分 |
| USP10敲低实验 | shRNA序列和来源（Sigma-Aldrich pLKO.1puro）；三个独立hairpin；嘌呤霉素筛选浓度（1-2 μg/ml）；Polybrene浓度（8 μg/ml）；敲低效率验证 阅读提示：Figure 4a-e及图注；Online Methods的KD of genes by shRNA部分 |
| USP10过表达和共免疫沉淀 | USP10 wt和C424S突变体的构建；慢病毒感染条件（Polybrene 5 μg/ml）；嘌呤霉素筛选浓度（1 μg/ml）；共免疫沉淀使用的FLT3和USP10抗体 阅读提示：Figure 4f-g及图注；Online Methods的Overexpression of USP10 wild-type and mutant部分 |
| FLT3半衰期分析 | 环己酰亚胺浓度；HBX19818处理浓度；时间点设置；wt FLT3和FLT3-ITD半衰期数值 阅读提示：Figure 4h及图注；Results的USP10 stabilizes FLT3-ITD to a greater extent than wt部分 |
| 克服FLT3激酶抑制剂耐药 | TKD点突变类型；midostaurin耐药MOLM13细胞的建立方法；化合物处理浓度和时间（24小时） 阅读提示：Figure 5a-h及图注；Results的Degradation of mutant FLT3 overcomes resistance部分 |
| 联合用药协同分析 | HBX19818与midostaurin或crenolib的固定比例；IC50倍数浓度（0.25X、0.5X、1X、2X、4X）；Calcusyn软件版本；CI值判定标准 阅读提示：Figure 6a-b及图注；Online Methods的Drug combination studies部分 |
| 原代患者样本和PDX体外药效 | 原代AML患者样本的突变信息和临床特征；primagraft来源（proxe.org）；处理时间（约72小时）；化合物浓度范围 阅读提示：Figure 6c-e及图注；Online Methods的AML patient cells和Primagraft study部分 |
| 体内药效实验（primagraft模型） | P22077剂量（15 mg/kg）、给药途径（IP QD）、治疗持续时间（21天）；小鼠品系（NSG，雌性，6周龄）；每组小鼠数量（n=3）；白血病负荷起始标准（CD45+CD33+细胞百分比） 阅读提示：Online Methods的Primagraft study部分；Supplementary Figure 10f |
| 体内药效实验（生物发光模型） | P22077剂量（50 mg/kg）、给药途径（IP BID或PO QD）；细胞接种量（0.5×10^6 cells/250 μL IV）；小鼠品系（NCR-nude，雌性，6-8周龄）；每组小鼠数量（n=8）；统计方法（双尾Student t检验） 阅读提示：Online Methods的Non-invasive in vivo bioluminescence study部分；Figure 6g-h及图注 |