计算建模筛选连接子长度
筛选能使BH3/BCL-xL复合物定位于SOScat活性位点并实现自抑制的连接子组合。
以RosettaRemodel将BH3/BCL-xL复合物视为刚体，通过环闭合采样N端和C端连接子长度组合，并以μ均值与标准差评估复合物相对SOScat活性位点的定位。
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计算工程化的RAS变阻器揭示RAS-ERK信号动态
A computationally engineered RAS rheostat reveals RAS-ERK signaling dynamics.
实验完整度
高含计算建模、体外核苷酸交换、细胞系信号检测、PRM-MS磷酸化及定量磷酸蛋白组学多层级验证
主要模型
Flp-In T-REx 293细胞（CIAR-293与xCIAR-293） MCF10A细胞（CIAR-MCF10A） 纯化重组蛋白体外核苷酸交换体系
重点核对
A3处理CIAR-293细胞的剂量（4、10、25 μM）与时间（30 min、0–150 min） EGF刺激剂量（2或10 ng/mL）与时间进程 CIAR与失活对照xCIAR的比较 维莫非尼预处理浓度（1 μM）及时间（1 h） 磷酸蛋白组学iTRAQ标记与30 min刺激时间点
摘要
用用户自定义输入控制的合成蛋白开关是研究和控制动态细胞过程的有力工具。迄今为止，这些方法主要依赖于分子间调控。在这里，我们报道了一个计算指导的框架，用于工程化蛋白质功能的分子内调控。我们利用该框架开发了化学诱导型RAS激活剂（CIAR），这是一种单组分RAS变阻器，可响应小分子直接激活内源性RAS。使用CIAR，我们发现直接激活RAS引发的RAS/ERK信号动态与生长因子刺激显著不同，且这些动态在细胞类型之间存在差异。我们还发现，临床批准的RAF抑制剂维莫非尼（vemurafenib）能有效使细胞对直接野生型RAS激活产生响应。这些结果证明了CIAR在定量探究RAS信号方面的实用性。最后，我们通过将该方法应用于Rho家族GEF，证明了我们设计分子内调控蛋白质工具方法的普遍实用性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否通过计算指导的分子内调控工程化构建单组分RAS变阻器，并用以比较直接RAS激活与生长因子刺激下的RAS/ERK信号动态。
- 核心机制
- 将BH3肽与BCL-xL通过柔性连接子连接于组成型活性SOScat两端，BH3/BCL-xL复合物遮挡SOScat活性位点实现自抑制；小分子A-385358破坏该复合物后释放活性位点，直接激活内源性RAS。
- 主要证据
- 体外核苷酸交换实验显示候选CIAR构建体呈BH3竞争肽剂量依赖性RAS GEF活性增加；CIAR-293与xCIAR-293细胞的SRE报告基因和磷酸化ERK免疫印迹显示A3剂量依赖性ERK磷酸化；PRM-MS与定量磷酸蛋白组学比较了直接RAS激活与EGF刺激的磷酸化动态差异。
- 研究意义
- 作者提出CIAR可用于定量探究RAS信号，且其计算框架可推广至结构多样的蛋白质，用于指导分子内调控系统的工程化设计。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外核苷酸交换验证候选构建体
验证候选CIAR构建体能否在BH3竞争肽存在下激活RAS。
在体外核苷酸交换实验中测试候选CIAR构建体对HRAS的GEF活性，比较竞争BH3肽与对照BH3肽条件下的反应。
细胞水平筛选与RAS/ERK通路验证
在细胞中筛选连接子空间并评估CIAR对RAS/ERK通路的激活能力。
用血清反应元件（SRE）荧光素酶报告基因检测候选构建体，并建立稳定表达CIAR或失活对照xCIAR的细胞系，通过磷酸化ERK免疫印迹评估A3处理效果。
RAS/ERK信号动态与RAF调控解析
比较直接RAS激活与EGF刺激的时间动态，并探究RAF位点及维莫非尼对通路的调控。
在CIAR-293和CIAR-MCF10A中进行A3或EGF时间进程免疫印迹，用RBD pull-down检测RAS•GTP，用PRM-MS检测RAF1 S29、S259和BRAF S365磷酸化，并用维莫非尼预处理后检测ERK磷酸化。
定量磷酸蛋白组学分析信号传播
比较直接RAS激活与EGF刺激下下游磷酸化位点的差异与动态。
对CIAR-293和xCIAR-293细胞给予DMSO、A3或EGF处理30 min后进行iTRAQ标记定量磷酸蛋白组学，并进行时间进程聚类分析，代表性肽段用PRM-MS验证。
计算框架推广至Rho家族GEF
检验该计算框架能否用于其他结构不同蛋白的分子内调控设计。
回顾性评估已构建的诱导型ITSN，并将框架应用于设计诱导型VAV构建体，用体外鸟苷酸交换实验检测其活性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证蛋白功能变化
验证分子表达与信号变化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 计算建模 | RosettaRemodel | -- | -- |
| 药物处理 | A-385358（A3） | -- | -- |
| 蛋白纯化 | Promega HisLink™树脂 | Promega | -- |
| 体外核苷酸交换 | MANT-GDP | Life Technologies | M-12414 |
| Victor3 V多标记板读数仪 | Perkin Elmer | -- | |
| 细胞培养与转染 | XTremeGENE-HP转染试剂 | Roche | -- |
| SRE报告基因检测 | Dual-Glo™检测系统 | Promega | -- |
| AZD6244 | Selleck Chemicals | -- | |
| 免疫印迹 | 总ERK抗体 | Cell Signaling Technology | 9107 |
| 磷酸化ERK抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| 磷酸化AKT（pS473）抗体 | Cell Signaling Technology | 4060 | |
| 磷酸化AKT（T303）抗体 | Cell Signaling Technology | 13038 | |
| AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 2920 | |
| 磷酸化EGFR（Y1068）抗体 | Cell Signaling Technology | 2236 | |
| α-微管蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 3873 | |
| RAF1抗体 | BD Transduction Labs | 610151 | |
| RAS活性检测 | Pan-RAS激活试剂盒 | Cell Biolabs | -- |
| 磷酸蛋白组学样品制备 | 测序级修饰胰蛋白酶 | Promega | -- |
| Sep-Pak Plus C18柱 | Waters | -- | |
| 8-plex iTRAQ试剂 | AB Sciex | -- | |
| 磷酸肽富集 | Ni-NTA Superflow珠 | Qiagen | -- |
| 质谱分析 | nanoAcquity UPLC系统 | Waters | -- |
| Velos-Pro/Orbitrap-Elite混合质谱仪 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| Xbridge C18捕集柱 | Waters | -- | |
| PRM质谱分析 | Q-exactive Plus质谱仪 | Thermo | -- |
| mant-GDP | Life Technologies | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞系构建与诱导表达 | Flp-In T-REx 293稳定表达CIAR或xCIAR；多西环素1 μg/mL诱导；MCF10A慢病毒转导与嘌呤霉素筛选 阅读提示：Online Methods中“Cell culture and stable cell line generation”及Supplementary Methods |
| A3/EGF刺激条件 | A3剂量（4、10、25 μM）及处理时间；EGF剂量（2或10 ng/mL）；血清饥饿过夜与DMSO对照 阅读提示：Figure 3图注及Online Methods“Immunoblotting” |
| 维莫非尼预处理 | 维莫非尼浓度1 μM、预处理1 h、A3 10 μM刺激时间 阅读提示：Figure 4e–g图注及Online Methods |
| 磷酸蛋白组学 | A3 10 μM、EGF 10 ng/mL处理30 min；iTRAQ 8-plex标记；肽段FDR 2.5% 阅读提示：Figure 5图注、Online Methods中样品制备与数据处理小节 |
| 体外核苷酸交换实验 | CIAR 250 nM、MANT-GDP 200 nM、HRAS-GDP 10 μM、BH3肽浓度、终体积125 μL、三重复 阅读提示：Online Methods“Guanine nucleotide exchange assays” |