Val-boroPro诱导单核/巨噬细胞死亡
确定Val-boroPro对单核/巨噬细胞系的细胞毒性效应及选择性。
用Val-boroPro处理THP-1巨噬细胞、原代mBMDMs、hPBMCs及多种细胞系，检测LDH释放和IL-1β分泌。
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DPP8和DPP9抑制诱导前体caspase-1依赖的单核细胞和巨噬细胞焦亡
DPP8 and DPP9 inhibition induces pro-caspase-1-dependent monocyte and macrophage pyroptosis.
实验完整度
高体外细胞系、原代细胞、基因敲除验证及体内小鼠模型，涵盖功能与机制验证
主要模型
THP-1单核/巨噬细胞系 RAW 264.7巨噬细胞系 原代小鼠骨髓来源巨噬细胞（mBMDMs） Casp1−/−及野生型C57BL/6NJ小鼠
重点核对
Val-boroPro处理浓度2 μM、时间24 h（LDH/ELISA）或48 h（CellTiter-Glo） CRISPR-Cas9敲除DPP8、DPP9、caspase-1、ASC、GSDMD等基因并验证蛋白缺失 Val-boroPro剂量100 μg/小鼠口服，6 h后检测血清G-CSF和CXCL1/KC 使用Ac-YVAD-CMK或Z-VAD-FMK（50 μM，预处理30 min）验证caspase-1催化活性依赖性 LDH释放和CellTiter-Glo实验均设置三个生物学重复，统计采用双侧Student's t检验
摘要
Val-boroPro（talabostat，PT-100）是一种非选择性后脯氨酸切割丝氨酸蛋白酶抑制剂，通过未知机制刺激哺乳动物免疫系统。尽管缺乏机制理解，Val-boroPro作为潜在抗癌剂已引起显著兴趣，并进入人体III期试验。本研究表明，Val-boroPro通过触发单核细胞和巨噬细胞中一种称为焦亡的促炎性细胞死亡形式来刺激免疫系统。我们证明，抑制两种丝氨酸蛋白酶DPP8和DPP9可激活caspase-1的前体形式，且不依赖炎症小体衔接蛋白ASC。活化的前体caspase-1不能有效加工自身或IL-1β，但能切割并激活gasdermin D以诱导焦亡。缺乏caspase-1的小鼠在接受Val-boroPro治疗后不显示免疫刺激。我们的数据鉴定了第一个诱导焦亡的小分子，并揭示了一个控制先天免疫系统激活的新检查点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Val-boroPro刺激免疫系统的分子和细胞机制是什么，包括关键丝氨酸蛋白酶靶点、信号通路和受影响的细胞类型。
- 核心机制
- Val-boroPro抑制DPP8和DPP9，激活前体caspase-1（不依赖ASC和自身自切割），活化的前体caspase-1切割GSDMD诱导单核细胞和巨噬细胞焦亡，从而刺激免疫系统。
- 主要证据
- 在THP-1、RAW 264.7、J774、原代mBMDMs和hPBMCs中，Val-boroPro诱导LDH释放和GSDMD切割；caspase-1或DPP8/9敲除细胞抵抗细胞死亡；Casp1−/−小鼠中Val-boroPro不再诱导血清G-CSF和CXCL1/KC升高。
- 研究意义
- 鉴定了首个诱导焦亡的小分子，并揭示DPP8/9作为控制先天免疫系统激活的新检查点，为癌症免疫治疗提供新方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定DPP8/9为关键靶点
确定Val-boroPro抑制后导致细胞死亡的关键丝氨酸蛋白酶。
利用CRISPR-Cas9敲除DPP4、DPP7、DPP8、DPP9，并用1G244及选择性抑制剂处理，检测LDH释放。
验证caspase-1依赖性
检验Val-boroPro诱导的细胞死亡是否依赖caspase-1。
用sgRNA敲除caspase-1、caspase-4、caspase-5，检测LDH释放和CellTiter-Glo活力。
分析caspase-1活化形式及ASC非依赖性
确定Val-boroPro激活的caspase-1形式及是否依赖ASC。
免疫印迹检测细胞提取物和上清中的caspase-1、IL-1β、IL-18；用Ac-WEHD-AFC荧光底物检测caspase-1活性；敲除ASC验证。
验证GSDMD切割及在焦亡中的作用
检验GSDMD是否被切割并介导Val-boroPro诱导的焦亡。
免疫印迹检测GSDMD切割；敲除GSDMD后检测LDH释放延迟。
体内验证caspase-1依赖性免疫刺激
确认caspase-1在Val-boroPro诱导的体内免疫刺激中的作用。
给野生型和Casp1−/−小鼠口服Val-boroPro，检测血清G-CSF和CXCL1/KC。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞死亡与功能
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| RPMI-1640培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 佛波酯 | Sigma | -- | |
| 重组巨噬细胞集落刺激因子 | PeproTech | -- | |
| 药物处理 | Val-boroPro | -- | -- |
| 1G244 | -- | -- | |
| 脂多糖 | Santa Cruz Biotechnology | -- | |
| 尼日利亚菌素 | Cayman Chemical Company | -- | |
| Ac-YVAD-CMK | Cayman Chemical Company | -- | |
| Z-VAD-FMK | Enzo Life Sciences | -- | |
| 依托泊苷 | Enzo Life Sciences | -- | |
| 西格列汀 | Sigma | -- | |
| 维格列汀 | Cayman Chemical Company | -- | |
| 沙格列汀 | Toronto Research Chemicals | -- | |
| LDH检测 | LDH细胞毒性检测试剂盒 | Pierce | -- |
| ELISA | IL-1β酶联免疫吸附测定试剂盒 | R&D Systems | -- |
| CellTiter-Glo检测 | CellTiter-Glo试剂 | Promega | -- |
| caspase-1活性检测 | caspase-1荧光活性检测试剂盒 | R&D Systems | -- |
| Ac-WEHD-AFC | -- | -- | |
| Western blot | 人caspase-1抗体 | Cell Signaling Technology | 2225 |
| 小鼠caspase-1抗体 | Adipogen | -- | |
| GSDMD抗体 | Novus Biologicals | NBP2-33422 | |
| DPP8抗体 | Abcam | ab42076 | |
| DPP9抗体 | Abcam | ab42080 | |
| GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞死亡检测 | Val-boroPro处理浓度（2 μM）和时间（24 h），THP-1分化条件（50 ng/mL PMA，3天） 阅读提示：Methods中“LDH cytotoxicity and IL-1β ELISA assays”小节及Figure 1图注 |
| 基因敲除验证 | sgRNA序列（Supplementary Table 2），敲除验证方法（免疫印迹或FP-biotin富集） 阅读提示：Methods中“Knockout cell lines”小节及Supplementary Table 2 |
| 体内细胞因子刺激 | Val-boroPro剂量（100 μg/小鼠）、给药方式（口服）、采血时间（6 h）、小鼠品系和样本量（每组5只） 阅读提示：Methods中“Cytokine stimulation in mice”小节及Figure 6图注 |
| caspase-1活性抑制 | Ac-YVAD-CMK或Z-VAD-FMK浓度（50 μM）、预处理时间（30 min） 阅读提示：Methods中“Reagents and antibodies”及Figure 4f图注 |