scTL-seq方法建立与优化
建立可在纳克级RNA和单胚胎水平检测新生RNA的测序方法。
基于TimeLapse-seq，利用4sU标记、TFEA/NaIO4化学转化和T-to-C突变检测新生RNA；在293T细胞中从2 µg降至10 ng RNA测试，并比较柱纯化等RNA提取方法；随后在小鼠ESC和胚胎中测试4sU浓度(200 µM、1 mM、2 mM、5 mM)及处理时间。
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单细胞TimeLapse-seq揭示MTA是协调小鼠合子基因组激活的关键逆转录转座子
Single-cell TimeLapse-seq reveals MTA is an essential retrotransposon orchestrating mouse zygotic genome activation.
实验完整度
高包含单胚胎/单细胞新生RNA测序、胚胎显微注射敲低、RT-qPCR、免疫荧光、DNase I-TUNEL及多组学数据整合等多层级功能与机制验证
主要模型
小鼠单个早期胚胎(GV、PN3、PN5、E2C、M2C、L2C、4C、桑椹胚) MII卵母细胞与体外受精胚胎 293T细胞 小鼠胚胎干细胞(ESC)
重点核对
4sU标记浓度与时间：小鼠胚胎使用2 mM 4sU处理4 h，293T细胞使用100 µM 4sU处理4 h MTA-ASO注射方式与时期：MII卵母细胞或合子注射，ASO终浓度15 µM，注射量约10 pl 新生转录本判定阈值：T to C/T to A > 3，新生RPKM > 1(基因)或新生RPM > 0.3(至少两个生物学重复，TE) 单胚胎与池化胚胎一致性：单桑椹胚与25枚池化桑椹胚的新生基因数目和突变率可比 SNP亲本来源判定：C57BL/6雌鼠卵母细胞与PWK雄鼠精子，基于株特异性SNP区分母源与父源reads
摘要
转座元件(TE)在哺乳动物早期胚胎发生过程中被时序性激活，并与合子基因组激活(ZGA)密切相关，然而由于灵敏度有限和母源RNA背景的干扰，其新生转录动态仍未完全解析。在此，我们开发了单细胞TimeLapse测序(scTL-seq)，能够在单个胚胎中实现等位基因分辨的新生RNA检测。将scTL-seq应用于小鼠ZGA，我们生成了基因和TE的精细转录图谱，并鉴定了原核(PN)期激活的基因和TE。我们发现PN期的转录主要来源于母源基因组，并富集了在生发泡卵母细胞中高转录的基因。类似地，小鼠转录本A型(MTA)元件在卵母细胞中转录，并在PN期高度活跃。MTA敲低破坏合子基因激活并使数百个TE亚家族失调，导致1细胞期胚胎阻滞。利用新生转录本，我们进一步鉴定了662个TE驱动的嵌合转录本，并表明TE对于调控关键发育基因(包括Nfya、Setd2和Tead4)是必需的。最后，我们鉴定出包括NOBOX在内的母源转录因子是MTA激活的潜在调控因子。总之，我们的研究提供了小鼠ZGA的高分辨率新生转录组图谱，并揭示了MTA逆转录转座子在协调早期胚胎发育中的重要调控作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 小鼠合子基因组激活过程中基因和转座元件的新生转录动态如何，以及首个激活的逆转录转座子MTA在ZGA和早期胚胎发育中发挥什么作用。
- 核心机制
- MTA在PN期高转录，通过顺式调控邻近ZGA基因(包括W1基因)的表达并抑制其他TE(如ERVK、L1亚家族)的过早激活，从而协调ZGA起始；同时TE可作为启动子形成嵌合转录本(如MTB-Nfya、ORR1B1-Setd2、MT2-Tead4)补充关键基因转录。
- 主要证据
- scTL-seq在单胚胎水平鉴定出PN3至4C阶段3825个ZGA基因和9952个TE位点的新生转录；MTA-ASO注射导致1细胞期阻滞、W1/W2/W3基因激活失败及392个TE亚家族上调；DNase I-TUNEL显示MTA敲低增加PN5期染色质可及性；siRNA/CRISPRi/CRISPR KO验证MTB-Nfya、ORR1B1-Setd2和MT2-Tead4嵌合转录本功能。
- 研究意义
- 提供了小鼠ZGA的高分辨率新生转录组图谱，重新定义ZGA为三个转录波次，揭示MTA-MaLR是最早激活的逆转录转座子并作为ZGA起始和早期胚胎发育的关键调控因子。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
小鼠ZGA新生转录图谱构建
解析GV至桑椹胚阶段基因和TE的新生转录动态。
对GV、PN3、PN5、E2C、M2C、L2C、4C和桑椹胚进行scTL-seq，鉴定各阶段新生基因和新生TE，并进行PCA、聚类和GO分析。
亲本来源与母源-合子转录验证
确定PN期转录本的亲本来源及母源-合子转录本是否输出至细胞质。
利用C57BL/6雌鼠与PWK雄鼠杂交，基于SNP区分母源和父源reads；对PN3胚胎进行4sU标记后洗脱并加入Pol I/Pol II抑制剂(CX5461和DRB)处理4 h，分离全胚胎和细胞质组分进行scTL-seq。
TE时序性转录及与基因共激活分析
解析ZGA期间TE的时序激活模式及其与邻近基因的转录相关性。
基于唯一比对reads定量GV至4C阶段TE拷贝水平转录，对TE进行聚类，分析LTR、LINE、SINE表达及TE与基因距离和转录相关性。
MTA功能验证
验证MTA在早期胚胎发育和ZGA基因激活中的作用。
设计靶向MTA_Mm和MTA_Mm-int的ASO，分别注射MII卵母细胞和合子，观察发育表型，并通过RT-qPCR和RNA-seq分析基因与TE表达变化；用DNase I-TUNEL检测染色质可及性。
TE驱动嵌合转录本鉴定与功能验证
鉴定以TE为启动子的嵌合转录本并验证其对早期发育的作用。
通过StringTie2组装和HIT流程鉴定TE来源TSS，共鉴定662个TE来源TSS；针对MTB-Nfya注射siRNA，针对ORR1B1-Setd2和MT2-Tead4进行CRISPR KO和CRISPRi，评估转录和发育表型。
MTA潜在调控因子分析
鉴定调控MTA激活的转录因子。
分析MTA_Mm基序富集，结合已发表小鼠早期胚胎蛋白质组数据筛选候选转录因子；利用ESC-to-oocyte体外分化及Nobox敲除RNA-seq数据(GSE143218)检测全长MTA表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养与4sU标记 | 4-硫尿苷 | Sigma-Aldrich | T4509 |
| RNA提取 | RNAiso Plus试剂 | Takara Bio | 9109 |
| 卵母细胞收集与培养 | M2培养基 | Sigma-Aldrich | M7167 |
| 体外受精 | IVF plus培养基 | Vitrolife | 10136 |
| 胚胎透明带去除 | 链霉蛋白酶E | Sigma | P8811 |
| scTimeLapse-seq | 蛋白酶K | -- | -- |
| GB缓冲液 | Takara | 9765 | |
| DNase I | Takara | 9765 | |
| RNA clean XP磁珠 | Beckman Coulter | A63987 | |
| 2,2,2-三氟乙胺 | Sigma | 269042 | |
| SMARTer链特异性总RNA测序试剂盒V2 | Takara Bio | 634414 | |
| 低输入TimeLapse-seq | RNA Clean & Concentrator-5柱 | Zymo Research | R1016 |
| DNase I试剂盒 | Zymo Research | E1010 | |
| 4sU-seq | EZ-Link Biotin-HPDP | Life | A35390 |
| Dynabeads MyOne链霉亲和素T1磁珠 | Invitrogen | 91217737 | |
| 新生RNA核输出检测 | DRB | Sigma | D1916 |
| CX5461 | Selleck | S2684 | |
| 细胞质组分分离 | NE-PER细胞质提取试剂 | Thermo | 78833 |
| 体外转录模板构建 | AgeI限制性内切酶 | ABclonal | R3552S |
| 体外转录 | Mmessage mMACHINE T7 ULTRA转录试剂盒 | Thermo Scientific | AMB13455 |
| RNA纯化 | RNA Clean磁珠 | Vazyme | N412 |
| sgRNA体外转录 | MEGAshortscript T7转录试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | AM1354 |
| 质粒构建与CRISPR | PrimeSTAR Max 2×预混液 | Takara | R045B |
| RT-qPCR | SYBR Premix Ex Taq II | Takara | RR820A |
| DNase I-TUNEL | DeadEnd荧光TUNEL检测系统 | Promega | G3250 |
| 免疫荧光染色 | 抗磷酸化组蛋白H2A.X(Ser139)抗体 | CST | 9718 |
| 抗SOX2抗体 | R&D System | AF2018 | |
| 抗CDX2抗体 | Abcam | ab76541 | |
| 测序 | NovaSeq 6000测序仪 | -- | -- |
| 成像 | ZEISS LSM 880显微镜 | ZEISS | LSM 880 |
| FV3000激光扫描共聚焦显微镜 | OLYMPUS | FV3000 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| scTL-seq新生RNA标记 | 4sU浓度与处理时间：小鼠胚胎2 mM处理4 h，293T细胞100 µM处理4 h；GV卵母细胞在含2.5 µM mirinone和2 mM 4sU的M2培养基中处理4 h 阅读提示：Methods中'Cell culture and 4sU treatment'与'Embryo collection and 4sU treatment'小节 |
| 单胚胎scTL-seq | 单胚胎裂解体系、DNase I处理、RNA纯化、TFEA/NaIO4转化条件(45°C 30 min)、PCR扩增循环数(19 cycles)及测序平台 阅读提示：Methods中'Single-cell (sc) TimeLapse-seq'小节 |
| MTA-ASO敲低 | ASO浓度15 µM、注射量约10 pl、注射时期(MII卵母细胞或合子)、对照NC-ASO序列、检测时间点12 hpf和36 hpf 阅读提示：Methods中'MTA-targeting ASO design'和'Embryo microinjection'小节，Fig. 4c–f图注 |
| TE嵌合转录本功能验证 | MTB-Nfya siRNA浓度20 µM、注射量约10 pl；ORR1B1-Setd2和MT2-Tead4的sgRNA 100 ng/µl及Cas9/dCas9-KRAB mRNA 100 ng/µl；对照仅注射sgRNA 阅读提示：Methods中'MTB-Nfya targeting siRNA'、'CRISPR and CRISPRi targeting TEs'和'Embryo microinjection'小节，Fig. 5d–k图注 |
| 亲本来源SNP分析 | 母本C57BL/6雌鼠与父本PWK雄鼠品系、SNP位点过滤标准(读段末端5 bp内和碱基质量<30的位点排除)、母源/父源reads判定规则 阅读提示：Methods中'Assignment of allelic-specific nascent reads'小节，Fig. 2f–i图注 |
| DNase I-TUNEL染色质可及性检测 | 胚胎时期(1C，12 hpf)、透化条件(0.5% Triton X-100提取缓冲液5 min)、DNase I浓度1 U/mL处理5 min、TUNEL检测系统及成像设备 阅读提示：Methods中'In vivo DNase I-TUNEL staining'小节，Fig. 4q–r图注 |