果实发育阶段划分与组织学分析
建立草莓花和早期果实的形态学与组织学分期体系，确定关键发育转折点。
基于形态和组织学特征将花与果实发育分为stage 0至stage 8共九个阶段；对早期果实进行半薄切片和Safranin O-Fast Green染色，并量化花托和瘦果的纵横径。
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时空单细胞转录组图谱揭示受精诱导的生长素信号驱动草莓坐果与发育
A spatiotemporal single-cell transcriptomic atlas reveals fertilization-induced auxin signaling driving strawberry fruit set and development.
实验完整度
高整合snRNA-seq、空间转录组、空间代谢组学及稳定转基因功能验证（CRISPR、RNAi、OE）
主要模型
森林草莓Fragaria vesca Yellow Wonder 5AF7果实 栽培草莓‘Monterey’（功能鉴定） 稳定转基因草莓株系（ProDR5::RUBY、FveARF6-CRISPR/RNAi/OE） 本氏烟草叶片（瞬时表达与互作验证）
重点核对
snRNA-seq覆盖受精后（stage 2）、坐果（stage 3）和果实膨大（stage 5）三个发育阶段，每阶段两个生物学重复，Pearson相关系数>0.91 空间转录组10× Visium覆盖相应阶段，两个生物学重复，共获得7654个空间bin FveARF6稳定转基因株系（CRISPR敲除、RNAi沉默、过表达）的表型定量与基因型鉴定 NAA（500 µM）与NPA（100 µM）处理从S3开始每2天喷施至第12天，评估果实空腔与大小 FveIAA26-GST蛋白在0.1 mM NAA处理后的无细胞降解实验，取样时间点0、0.5、1、2、3 h
摘要
受精触发的坐果与形态建成是一个复杂的发育程序，涉及果实组织内多种细胞群体。然而，这一过程的细胞异质性长期掩盖了不同细胞类型的具体贡献。本文以森林草莓（Fragaria vesca）为模型，整合空间转录组学、单核RNA测序（snRNA-seq）和空间代谢组学，构建了覆盖受精后、坐果和果实膨大阶段的全面高分辨率草莓果实单细胞图谱。三种主要细胞类型的拟时序轨迹揭示了显著的发育状态转变，并观察到生长素信号组分的特异性表达模式。整合空间代谢组学与ProDR5::RUBY稳定报告系，揭示了塑造果实形态建成的生长素分布不对称性。这种分布不对称性与生长素转运组分FvePIN1和FvePIN5共同相关，并在花托中表现出不同的时间特异性。响应生长素，FveARF6作为果实发育的关键正调控因子发挥作用，这一点由稳定转基因株系FveARF6-RNAi、FveARF6-CRISPR敲除和FveARF6过表达所证明。总之，本研究为理解受精诱导的果实发育与形态建成的细胞和分子机制提供了时空框架。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 受精诱导的生长素信号如何在草莓花托中通过细胞类型特异的转运与响应机制驱动坐果、果实膨大与形态建成。
- 核心机制
- 种子来源的生长素经FvePIN1和FvePIN5介导转运至花托，在皮层与髓部之间形成不对称分布；FveARF6作为关键正调控因子响应生长素并受FveIAA26抑制，进而调控细胞分裂与细胞壁相关基因，驱动花托发育与形态建成。
- 主要证据
- snRNA-seq与空间转录组联合构建细胞图谱；ProDR5::RUBY和ProDR5::GUS报告系及空间代谢组学（AFADESI-MSI检测IAA）揭示生长素分布不对称；FveARF6-CRISPR、RNAi和过表达稳定转基因株系显示花托宽度和长度改变；酵母双杂交、共荧光素酶互补和pull-down验证FveARF6与FveIAA26互作；无细胞降解实验显示FveIAA26在NAA处理后2小时内降解。
- 研究意义
- 构建了草莓果实发育的时空单细胞图谱，揭示液泡果实发育中生长素分布不对称与FveARF6功能的机制框架，为理解其他果实类型的发育机制及通过基因组编辑辅助育种改良果实大小和品质提供科学基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单核RNA测序构建果实细胞图谱
解析受精后至果实膨大阶段果实组织的细胞异质性和基因表达程序。
对stage 2、stage 3和stage 5的全果组织（含花托与瘦果）进行snRNA-seq，质控后获得32017个细胞，聚类得到21个细胞簇并进行标记基因注释。
空间转录组测序与细胞类型注释验证
为snRNA-seq图谱提供空间背景，辅助细胞类型注释并分析时空表达模式。
对相应阶段果实进行10× Visium空间转录组测序，结合H&E染色图像注释细胞类型；利用标记基因、RNA原位杂交和荧光原位杂交验证两种平台的对应关系。
拟时序轨迹与共表达网络分析
揭示维管束、薄壁和表皮细胞的发育轨迹及阶段相关基因模块。
对Vascular-Bundle、Parenchyma和Epidermis细胞进行Monocle2拟时序分析，并结合WGCNA鉴定阶段特异和细胞类型富集的基因模块及GO富集。
生长素转运蛋白空间表达与功能验证
确定参与花托生长素分布不对称的转运蛋白及其时空作用。
分析生长素转运基因的空间表达模式，通过原位杂交、GUS报告系和瞬时过表达验证FvePIN1与FvePIN5的定位；用NAA和NPA处理及FvePIN1/FvePIN5瞬时共过表达评估对果实空腔和形态的影响。
生长素分布检测与空间代谢组学
验证花托中生长素的空间分布及其随发育阶段的动态变化。
利用ProDR5::RUBY稳定转基因株系和ProDR5::GUS报告系监测生长素分布；采用AFADESI-MSI空间代谢组学联合LC-MS检测IAA在stage 0、2、3、5的空间分布，并分析细胞周期基因表达。
FveARF6稳定转基因功能验证
验证FveARF6在花托发育中的功能及对生长素的响应。
通过CRISPR/Cas9敲除、RNAi沉默和过表达稳定转基因株系，结合基因型鉴定和表型定量评估花托大小；用实时PCR检测离体生长素处理下FveARF6的表达。
FveARF6与FveIAA26互作及蛋白稳定性验证
验证FveARF6与FveIAA26的物理互作及生长素依赖的蛋白降解。
通过酵母双杂交、共荧光素酶互补和pull-down实验检测互作；用大肠杆菌表达纯化的GST-FveIAA26蛋白与NAA处理的草莓叶肉原生质体裂解液进行无细胞降解实验。
FveARF6敲除株系转录组分析
探究FveARF6介导果实发育的下游分子机制。
对FveARF6-CRISPR敲除株系果实进行bulk RNA测序，GO分析差异表达基因。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
空间代谢组学检测
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织切片 | Thermo Scientific HM 355S自动旋转切片机 | Thermo Scientific | HM 355S |
| 组织切片显微成像 | ZEISS Axiolab 5显微镜 | ZEISS | Axiolab 5 |
| 空间转录组 | Visium载玻片 | 10× Genomics | 3000394 |
| Visium空间基因表达载玻片 | 10× Genomics | 2000233 | |
| Illumina NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- | |
| 单核RNA测序 | BMKMANU DG1000 GEM试剂盒 | BMKMANU | -- |
| BMKMANU C1000芯片 | BMKMANU | C1000 | |
| Illumina NovaSeq X Plus测序仪 | Illumina | -- | |
| 单细胞悬液制备 | 红细胞裂解液 | Solarbio | -- |
| 荧光原位杂交 | SweAMI信号放大系统 | ServiceBio | -- |
| Cy3标记探针 | -- | -- | |
| DAPI | -- | -- | |
| 切片显微成像 | PANNORAMIC MIDI II显微扫描仪 | 3DHISTECH Ltd | MIDI II |
| 空间代谢组学 | Leica CM1950冷冻切片机 | Leica Microsystems | CM1950 |
| Orbitrap Exploris 120质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | Exploris 120 | |
| 固相萃取 | Oasis HLB固相萃取柱 | Waters | WAT094226 |
| UHPLC-MS/MS | Acquity UPLC HSS T3色谱柱 | -- | -- |
| 激素处理 | 萘乙酸 | PhytoTech | N600 |
| N-1-萘基邻氨甲酰苯甲酸 | Sigma-Aldrich | 33371 | |
| 蛋白提取 | 蛋白提取缓冲液 | Beyotime Biotechnology | P0013 |
| 免疫共沉淀 | 抗HA纳米抗体磁珠 | AlpalifeBio | KTSM1335 |
| 免疫印迹 | 抗HA抗体 | Abcam | AB236632 |
| 抗mCherry抗体 | Proteintech | 26765-1-AP | |
| 抗GST抗体 | Abcam | AB111947 | |
| 蛋白表达 | pGEX-4T-1-BS-FveIAA26质粒 | -- | -- |
| 大肠杆菌Rosetta-gami (DE3) pLysS | -- | -- | |
| 蛋白表达诱导 | 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 | -- | -- |
| 稳定转化筛选 | 潮霉素B | -- | -- |
| 原生质体分离 | 纤维素酶R-10 | -- | -- |
| 离析酶R-10 | -- | -- | |
| 蜗牛酶 | -- | -- | |
| 亚细胞定位成像 | Nikon A1R HD25激光共聚焦显微镜 | Nikon | A1R HD25 |
| 空腔面积测量 | 在线网络工具（https://www.smartagriculture.top/） | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 果实发育阶段划分与取样 | 发育阶段判定标准（stage 2为2–4 DPA，stage 3为6–7 DPA，stage 5为10–15 DPA）及取样组织（全果含花托与瘦果） 阅读提示：Results 'Staging fruit development in F. vesca'及Fig. 1a |
| snRNA-seq | 每阶段生物学重复数（2个）、细胞数（32017）、测序平台与深度（每细胞至少50000 reads，PE150） 阅读提示：Methods 'Single-nucleus RNA-seq'及Supplementary Data 1 |
| 空间转录组 | 各阶段重复数（stage 3两个、stage 2和stage 5各一个）、切片厚度（stage 3为10 μm，stage 5为12 μm）、芯片类型 阅读提示：Methods '10× Visium spatial RNA-seq'及Supplementary Fig. 6 |
| NAA/NPA处理 | 处理浓度（NAA 500 µM、NPA 100 µM）、起始阶段（S3）、喷施频率（每2天至第12天）、对照（水）及助剂（两滴Tween 20） 阅读提示：Methods 'NAA treatment'及Fig. 5h–j |
| FveARF6稳定转基因 | CRISPR株系编号（+1,+1）和（-16,-16）、载体系统（JH4-JH12）、筛选浓度（2 mg/L hygromycin用于ProDR5::RUBY） 阅读提示：Methods 'Vector construction and stable transformation'及Supplementary Table 2 |
| FveIAA26无细胞降解 | NAA处理浓度（0.1 mM）与时间（24 h）、取样时间点（0、0.5、1、2、3 h）、抗GST抗体稀释比（1:10000） 阅读提示：Methods 'Cell-free degradation assay'及Fig. 7f |
| FveARF6基因表达诱导实验 | NAA喷洒浓度（0.1 mM）、取样时间点（0、3、6、9、12、24、48、72、120、168 h）、生物学重复数（3） 阅读提示：Methods 'NAA treatment'及Supplementary Fig. 31c–d |
| 空间代谢组学 | 切片厚度（25 μm）、检测阶段（stage 0、2、3、5）、AFADESI-MSI参数（溶剂流速、喷雾电压、扫描范围m/z 70–1000） 阅读提示：Methods 'Spatial metabolomics'及Fig. 6b |